„ZAŁĄCZNIK I

METODY POBIERANIA PRÓBEK

1. CEL I ZAKRES

Próbki przeznaczone do urzędowej kontroli pasz pobierane są zgodnie z metodami opisanymi poniżej. Próbki otrzymane w ten sposób uważa się za reprezentatywne dla kontrolowanych części.

Celem reprezentatywnego pobierania próbek jest uzyskanie niewielkiej frakcji partii w sposób gwarantujący, że oznaczenie jakiejkolwiek cechy szczególnej tej frakcji stanowi średnią cech całej partii. Próbki danej partii pobiera się poprzez wielokrotne pobieranie próbek pierwotnych w różnych miejscach partii. Próbki pierwotne są łączone poprzez ich zmieszanie w celu stworzenia próbki zbiorczej, z której przygotowuje się reprezentatywne próbki końcowe poprzez podział reprezentatywny.

Jeżeli z kontroli wzrokowej lub inaczej uzyskanych istotnych informacji wynika, że części paszy, z której mają być pobrane próbki, różnią się jakością od pozostałej części paszy z tej samej partii, części te oddziela się od pozostałej części paszy i traktuje jako oddzielną podpartię. Jeżeli podział paszy na oddzielne podpartie nie jest możliwy, należy pobrać próbki z paszy jako z jednej partii. W takim przypadku informację o tym zamieszcza się w sprawozdaniu z pobierania próbek.

Jeżeli pasza, z której pobrano próbki zgodnie z przepisami niniejszego rozporządzenia, zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE i jest ona częścią partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

Pobieranie próbek może również obejmować pasze oferowane do sprzedaży przez podmioty działające na rynku pasz za pośrednictwem środków porozumiewania się na odległość zgodnie z art. 11 ust. 3 rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 767/2009 (1). Pobieranie próbek pasz oferowanych do sprzedaży za pomocą środków porozumiewania się na odległość podlega co do zasady punktom określonym w niniejszym załączniku. Szczegółowe aspekty pobierania próbek paszy sprzedawanej na odległość opisano w pkt 11.

2. DEFINICJE

-

Partia: określona ilość paszy mająca wspólne cechy, takie jak pochodzenie, odmiana, rodzaj opakowania, pakujący, wysyłający lub etykietowanie, a w przypadku procesu produkcyjnego - jednostka produkcyjna wytworzona w jednym zakładzie z wykorzystaniem jednolitych parametrów produkcyjnych lub pewna ilość takich jednostek, w przypadku gdy są one produkowane w sposób ciągły i przechowywane razem.

-	Kontrolowana część: partia lub określona część partii lub podpartii.

-	Próbka zapieczętowana: próbka zapieczętowana w sposób uniemożliwiający dostęp do niej bez złamania lub usunięcia pieczęci.

-	Próbka pierwotna: ilość pobrana z jednego miejsca kontrolowanej części.

-	Próbka zbiorcza: sumaryczna ilość pierwotnych próbek pobranych z tej samej kontrolowanej części.

-	Próbka zredukowana: część próbki zbiorczej otrzymana z niej w procesie reprezentatywnej redukcji.

-	Próbka końcowa: część próbki zbiorczej (wymieszanej), próbki zredukowanej lub zhomogenizowanej próbki zbiorczej, w zależności od rodzaju kontroli (zob. pkt 9.4.).

-	Próbka laboratoryjna: próbka przeznaczona do celów laboratoryjnych (otrzymana przez laboratorium), która może być próbką końcową, zredukowaną lub zbiorczą.

-	Próbka paszy sprzedawanej na odległość: próbka partii paszy oferowanej do sprzedaży za pośrednictwem środków porozumiewania się na odległość.

3. PRZEPISY OGÓLNE

-	Próbki pobierane są przez osoby upoważnione do tego celu przez właściwy organ.

-	W odniesieniu do próbki paszy sprzedawanej na odległość właściwy organ zwraca się do podmiotu działającego na rynku pasz o przekazanie określonej ilości paszy za pomocą środków porozumiewania się na odległość.

-	Próbka musi być zapieczętowana w sposób uniemożliwiający dostęp do niej bez złamania lub usunięcia pieczęci.

Znak pieczęci musi być łatwo identyfikowalny i widoczny.

-	Identyfikacja próbki: próbka musi być oznaczona w sposób trwały i być zidentyfikowana w sposób pozwalający na jej jednoznaczne powiązanie ze sprawozdaniem z pobierania próbek.

-

Z każdej próbki zbiorczej lub zredukowanej pobiera się następujące próbki końcowe: należy pobrać jedną do celów kontroli (kontrola przestrzegania przepisów) i drugą dla podmiotu działającego na rynku pasz (próbka do celów obrony). Jedna dodatkowa próbka końcowa może zostać pobrana do celów referencyjnych. Jeżeli kompletna próbka zbiorcza zostaje zhomogenizowana, próbki końcowe pobierane są ze zhomogenizowanej próbki zbiorczej, chyba że procedura taka jest sprzeczna z przepisami państw członkowskich dotyczącymi praw podmiotu działającego na rynku pasz.

-

Zgodnie z art. 15 ust. 1 i 2 rozporządzenia (UE) 2017/625, jeżeli jest to konieczne do przeprowadzenia urzędowego pobierania próbek, w przypadku gdy wymagają tego właściwe organy, podmioty działające na rynku pasz: - zapewniają personelowi właściwych organów dostęp do wyposażenia znajdującego się pod ich kontrolą, w tym w razie potrzeby udostępniają odpowiedni sprzęt do pobierania próbek i środki ochrony indywidualnej; - pomagają personelowi właściwych organów i współpracują z nim w celu umożliwienia pobierania próbek, w tym udostępniają paszę personelowi właściwych organów.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Sprzęt do pobierania próbek musi być wykonany z materiałów, które nie zanieczyszczą kontrolowanego produktu. Sprzęt przeznaczony do wielokrotnego użytku musi być łatwy do utrzymania w czystości w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.

4.2. Sprzęt zalecany do pobierania próbek pasz stałych

4.2.1. Ręczne pobieranie próbek

4.2.1.1.

Szufelka do pobierania próbek o płaskim dnie i prostopadłych ściankach bocznych

4.2.1.2.

Ostrze probiercze z długą szczeliną lub z przegródkami. Wymiary ostrza probierczego muszą być dostosowane do charakterystyki kontrolowanej części (głębokość pojemnika, wymiary worka itp.) i do wielkości cząstek paszy. Jeżeli ostrze probiercze ma kilka otworów, w celu zagwarantowania pobierania próbek w różnych miejscach wzdłuż ostrza otwory powinny być oddzielone przegródkami lub należy zastosować naprzemienne otwory rozmieszczone sekwencyjnie.

4.2.2. Mechaniczne pobieranie próbek

Stosowne urządzenie mechaniczne może być użyte do pobierania próbek paszy w ruchu. Urządzenie mechaniczne uznaje się za właściwe, jeżeli pobiera się próbki co najmniej z całego odcinka przepływu.

Pobieranie próbek paszy w ruchu (przy dużym natężeniu przepływu) może być prowadzone przy użyciu automatycznych urządzeń.

4.2.3. Rozdzielacz

Jeżeli jest to możliwe i stosowne, w celu przygotowania próbek zredukowanych w sposób reprezentatywny powinien być stosowany sprzęt przeznaczony do rozdzielania próbki w przybliżeniu na równe części.

5. WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE LICZBY PRÓBEK PIERWOTNYCH

-

Wymogi ilościowe określone w pkt 5.1 i 5.2, dotyczące liczby próbek pierwotnych, mają zastosowanie do kontrolowanych części do wielkości maksymalnie 500 ton, które mogą być kontrolowane w reprezentatywny sposób. Opisana metoda pobierania próbek jest ważna również w odniesieniu do ilości większych niż podana wielkość maksymalna kontrolowanej części, pod warunkiem że zignorowana zostanie maksymalna liczba próbek pierwotnych podana w tabelach poniżej w pkt 5.1.1, 5.1.3 i 5.1.5, liczba próbek pierwotnych zostanie określona poprzez zastosowanie wzoru pierwiastkowego podanego w stosownej części procedury (zob. pkt 5.3), a minimalna wielkość próbki zbiorczej zostanie proporcjonalnie zwiększona. Powyższe nie stoi na przeszkodzie podzieleniu dużej partii na mniejsze podpartie i pobraniu próbek z każdej podpartii zgodnie z procedurą opisaną w pkt 5.1 i 5.2.

-	Wielkość kontrolowanej części musi umożliwiać pobranie próbek każdej części składowej.

-	W odniesieniu do bardzo dużych partii lub podpartii (> 500 ton) oraz partii transportowanych lub przechowywanych w sposób uniemożliwiający pobranie próbek zgodnie z procedurą przewidzianą w pkt 5.1 i 5.2 niniejszego rozdziału stosuje się metodę pobierania próbek przewidzianą w pkt 5.3.

-	W przypadku próbek paszy sprzedawanej na odległość właściwy organ na ogół nie ma informacji na temat wielkość partii, z której prosi o przekazanie określonej ilości. W związku z tym nie można zastosować metody, o której mowa w pkt 5.1 i 5.2. W takim przypadku stosuje się metodę opisaną w pkt 11.

-

Jeżeli podmiot działający na rynku pasz jest prawnie zobowiązany do spełnienia wymogów niniejszego rozporządzenia w ramach obowiązkowego systemu monitorowania, może on odejść od spełnienia wymogów ilościowych przewidzianych w niniejszym punkcie w celu uwzględnienia charakterystyki operacyjnej pod warunkiem że wykaże, w sposób wymagany przez właściwy organ, równoważność metody pobierania próbek pod względem reprezentatywności oraz po zatwierdzeniu przez właściwy organ.

-

W wyjątkowych przypadkach, jeżeli spełnienie wymogów ilościowych metody pobierania próbek nie jest możliwe ze względu na wystąpienie nieakceptowalnego komercyjnego uszkodzenia partii (ze względu na formy opakowań, środki transportu, sposób przechowywania itp.), możliwe jest zastosowanie alternatywnej metody pobierania próbek, pod warunkiem że jest ona możliwie jak najbardziej reprezentatywna, w pełni opisana i udokumentowana.

5.1. Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy

5.1.1. Pasze stałe luzem

Rozmiar kontrolowanej części	Minimalna liczba próbek pierwotnych
≤ 2,5 tony	7
> 2,5 tony	? (dwudziestokrotności liczby ton stanowiących kontrolowaną część) (*1) , do 40 próbek pierwotnych

5.1.2. Pasze płynne luzem

Rozmiar kontrolowanej części	Minimalna liczba próbek pierwotnych
≤ 2,5 tony lub ≤ 2 500 litrów	4 (*2)
> 2,5 tony lub > 2 500 litrów	7 (*2)

5.1.3. Pasze opakowane

Pasze (stałe i płynne) mogą być pakowane w torby, worki, puszki, beczki itd., określone w poniższej tabeli jako »jednostki«. Duże jednostki (≥ 500 kg lub litrów) muszą być kontrolowane zgodnie z przepisami dotyczącymi paszy luzem (zob. 5.1.1 i 5.1.2).

Rozmiar kontrolowanej części	Minimalna liczba jednostek, z których należy pobrać (co najmniej) jedną próbkę pierwotną (*3)
1 -20 jednostek	1 jednostka (*4)
21 -150 jednostek	3 jednostki (*4)
151 -400 jednostek	5 jednostek (*4)
> 400 jednostek	¼ ? (liczby jednostek stanowiących kontrolowaną część) (*5) , do 40 jednostek

5.1.4. Bloki paszy i lizawki mineralne

Kontroli należy poddać co najmniej jeden blok lub jedną lizawkę na kontrolowaną część obejmującą 25 jednostek, maksymalnie do czterech bloków lub lizawek.

W przypadku bloków lub lizawek ważących maksymalnie 1 kg próbką pierwotną jest zawartość jednego bloku lub jednej lizawki.

5.1.5. Pasze objętościowe i włókniste

Rozmiar kontrolowanej części	Minimalna liczba próbek pierwotnych (*6)
≤ 5 ton	5
> 5 ton	? (pięciokrotności liczby ton stanowiących kontrolowaną część) (*7) , do 40 próbek pierwotnych

5.2. Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w odniesieniu do kontroli składników lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy

Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych należy stosować w następujących przypadkach:

-	kontrola aflatoksyn, sporyszu żyta, innych mikotoksyn i szkodliwych zanieczyszczeń botanicznych w materiałach paszowych,

-	kontrola zanieczyszczenia krzyżowego przez składnik, w tym materiał modyfikowany genetycznie, lub substancję, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy.

Jeżeli organ kontrolny podejrzewa, że niejednolite rozmieszczenie ma miejsce również w przypadku zanieczyszczenia krzyżowego przez składnik lub substancję w mieszankach paszowych, można zastosować wymogi ilościowe określone w tabeli poniżej.

Rozmiar kontrolowanej części	Minimalna liczba próbek pierwotnych
< 80 ton	Zob. wymogi ilościowe w pkt 5.1. Liczbę próbek pierwotnych, które należy pobrać, mnoży się przez 2,5.
≥ 80 ton	100

5.3. Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w przypadku bardzo dużych partii

W przypadku dużych kontrolowanych części (> 500 ton) liczba próbek pierwotnych, które należy pobrać, wynosi 40 próbek pierwotnych + ? ton w odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy lub 100 próbek pierwotnych + ? ton w odniesieniu do kontroli składników lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy.

6. WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE PRÓBKI ZBIORCZEJ

Wymagana jest jedna próbka zbiorcza na kontrolowaną część.

	Rodzaj paszy	Minimalna wielkość próbki zbiorczej (*8) (*9)
6.1.	Pasze luzem	4 kg
6.2.	Pasze pakowane	4 kg (*10)
6.3.	Pasze płynne lub półpłynne	4 litry
6.4.	Bloki paszy lub lizawki mineralne:
6.4.1.	o wadze większej niż 1 kg	4 kg
6.4.2.	o wadze nie większej niż 1 kg	waga czterech oryginalnych bloków lub lizawek
6.5.	Pasze objętościowe i włókniste	4 kg (*11)

7. WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE PRÓBEK KOŃCOWYCH

Próbki końcowe

Wymagana jest analiza co najmniej jednej próbki końcowej. Ilość próbki końcowej potrzebnej do analizy jest nie mniejsza niż:

Pasze stałe	500 g (*12) (*13) (*14) (*15)
Pasze płynne lub półpłynne	500 ml (*12)

8. METODA POBIERANIA PRÓBEK W PRZYPADKU BARDZO DUŻYCH PARTII LUB PARTII PRZECHOWYWANYCH LUB TRANSPORTOWANYCH W SPOSÓB POWODUJĄCY, ŻE POBIERANIE PRÓBEK Z CAŁEJ PARTII NIE JEST MOŻLIWE

8.1. Zasady ogólne

Jeżeli sposób transportu lub przechowywania partii uniemożliwia pobieranie próbek pierwotnych z całej partii, próbki powinny w miarę możliwości być pobierane z partii w ruchu.

W przypadku dużych magazynów przeznaczonych do przechowywania paszy podmioty należy zachęcać do instalowania w nich sprzętu umożliwiającego (automatyczne) pobieranie próbek z całej przechowywanej partii.

W przypadku stosowania metod pobierania próbek przewidzianych w niniejszym punkcie podmiot działający na rynku pasz lub jego przedstawiciel jest informowany o metodzie pobierania próbek. Jeżeli metoda ta zostanie zakwestionowana przez podmiot działający na rynku pasz lub jego przedstawiciela, umożliwiają oni właściwemu organowi pobieranie próbek w całej partii na koszt podmiotu.

8.2. Duże partie transportowane statkiem

8.2.1. Dynamiczne pobieranie próbek z dużych partii transportowanych statkiem

Próbki z dużych partii na statkach powinny być w miarę możliwości pobierane, gdy produkt jest w ruchu (dynamiczne pobieranie próbek).

Próbki pobiera się w podziale na ładownie (jednostkę, którą można fizycznie rozdzielić). Ładownie są jednak opróżniane częściowo jedna po drugiej, więc początkowy podział fizyczny nie występuje po przetransportowaniu do miejsca przechowywania. Próbki można zatem pobierać w ramach początkowego podziału fizycznego lub w ramach podziału po transporcie do miejsca przechowywania.

Rozładunek statku może trwać kilka dni. Zasadniczo próbki należy pobierać w regularnych odstępach czasu podczas całego rozładunku. Jednakże nie zawsze jest możliwe lub stosowne, aby urzędowy inspektor był obecny przy pobieraniu próbek podczas całego rozładunku. Dlatego zezwala się na pobieranie próbek z części partii (kontrolowana część). Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części.

W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

Nawet jeżeli urzędowa próbka jest pobierana automatycznie, obecność inspektora jest wymagana. Jednakże jeżeli próbki pobierane są automatycznie przy wcześniejszym ustawieniu parametrów, których nie można zmienić w procesie pobierania próbek, zaś próbki pierwotne zbierane są do zapieczętowanego pojemnika, co uniemożliwia ewentualne oszustwa, wówczas obecność inspektora jest wymagana tylko na początku pobierania próbek, przy każdej zmianie pojemnika i pod koniec pobierania próbek.

8.2.2. Statyczne pobieranie próbek z partii transportowanych statkiem

Jeżeli pobieranie próbek odbywa się w sposób statyczny, należy zastosować procedurę przewidzianą dla miejsc przechowywania (silosów) dostępnych od góry (zob. pkt 8.4.1).

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii/ładowni (od góry). Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.3. Pobieranie próbek z dużych partii przechowywanych w magazynach

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii. Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.4. Pobieranie próbek z miejsc przechowywania (silosów)

8.4.1. Pobieranie próbek z silosów (łatwo) dostępnych od góry

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii. Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.4.2. Pobieranie próbek z silosów niedostępnych od góry (silosów zamkniętych)

8.4.2.1. Silosy niedostępne od góry (silosy zamknięte) o rozmiarze > 100 ton

Pasze przechowywane w takich silosach nie mogą być kontrolowane w sposób statyczny. Jeżeli zatem muszą być pobrane próbki z paszy przechowywanej w silosie i nie ma możliwości jej przeniesienia, należy uzgodnić z podmiotem, że poinformuje on inspektora o rozładunku silosu w celu umożliwienia pobrania próbek paszy w ruchu.

8.4.2.2. Silosy niedostępne od góry (silosy zamknięte) o rozmiarze < 100 ton

Metoda pobierania próbek polega na umieszczeniu 50-100 kg w pojemniku i pobraniu z niego próbki. Wielkość próbki zbiorczej odpowiada wielkości całej partii, a liczba próbek pierwotnych odpowiada ilości pobranej z silosu do pojemnika w celu pobrania próbek. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.5. Pobieranie próbek z paszy luzem w dużych zamkniętych pojemnikach

Próbki z takich partii często mogą być pobrane dopiero po rozładunku. W niektórych przypadkach nie jest możliwy rozładunek w miejscu przywozu lub kontroli, w związku z czym próbki powinny zostać pobrane w momencie rozładunku takich pojemników.

9. INSTRUKCJE POBIERANIA, PRZYGOTOWANIA I PAKOWANIA PRÓBEK

9.1. Wskazówki ogólne

Próbki należy pobierać i przygotowywać bez zbędnej zwłoki, przy zachowaniu środków ostrożności gwarantujących, że produkt nie ulegnie zmianie lub zanieczyszczeniu. Stosowany sprzęt, powierzchnie i pojemniki przeznaczone na próbki muszą być czyste i suche.

9.2. Próbki pierwotne

Próbki pierwotne należy pobrać losowo z całej kontrolowanej części, przy czym muszą być one równomiernie rozmieszczone i mieć w przybliżeniu jednakową wielkość.

Wielkość próbki pierwotnej wynosi co najmniej 100 g lub 25 g w przypadku pasz objętościowych i włóknistych o małej gęstości właściwej.

Jeżeli, zgodnie z metodą pobierania próbek ustanowioną w pkt 8, pobranych ma zostać mniej niż 40 próbek pierwotnych, wielkość próbek pierwotnych ustala się na podstawie wymaganej wielkości próbki zbiorczej, jaką należy osiągnąć (zob. pkt 6).

W przypadku pobierania próbek z małych partii opakowanej paszy, jeżeli zgodnie z wymogami ilościowymi pobrana ma zostać ograniczona liczba próbek pierwotnych, próbką pierwotną jest zawartość jednej oryginalnej jednostki, nieprzekraczająca 1 kg lub litra.

W przypadku pobierania próbek paszy opakowanej, składającej się z małych jednostek (np. < 250 g), wielkość próbki pierwotnej zależy od wielkości jednostki.

W przypadku próbek paszy sprzedawanej na odległość rozmiar próbki pierwotnej zależy od wielkości jednostki i w indywidualnych przypadkach może również zawierać mniej niż 100 g lub 100 ml.

9.2.1. Pasze luzem

W stosownych przypadkach próbki mogą być pobierane, gdy kontrolowana część paszy jest w ruchu (załadunek lub wyładunek).

9.2.2. Pasze opakowane

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5 część zawartości każdej jednostki usuwa się przy użyciu próbnika lub szufli. W miarę potrzeby próbki należy pobierać po opróżnieniu każdej jednostki oddzielnie.

9.2.3. Homogeniczne lub nadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5 należy w razie potrzeby zhomogenizować zawartość i pobrać materiał z każdej jednostki.

Próbki pierwotne mogą być pobierane w trakcie opróżniania zawartości pojemnika.

9.2.4. Nienadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5 należy pobrać próbki z różnych poziomów.

Próbki mogą być także pobierane w trakcie opróżniania pojemników, przy czym pierwsze frakcje należy odrzucić.

W każdym przypadku całkowita pobrana objętość nie może być mniejsza niż 10 litrów.

9.2.5. Bloki paszy i lizawki mineralne

Po wybraniu wymaganej liczby bloków lub lizawek w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5 należy pobrać część każdego bloku lub lizawki. Jeżeli podejrzewa się, że blok lub lizawka nie są homogeniczne, jako próbkę można pobrać cały blok lub lizawkę.

W przypadku bloków lub lizawek ważących maksymalnie 1 kg próbką pierwotną jest zawartość jednego bloku lub jednej lizawki.

9.3. Przygotowanie próbek zbiorczych

Próbki pierwotne miesza się w jedną próbkę zbiorczą.

9.4. Przygotowanie próbek końcowych

Materiał zawarty w próbce zbiorczej należy dokładnie wymieszać (2).

Każdą próbkę należy umieścić w odpowiednim pojemniku. Należy podjąć wszelkie środki ostrożności, aby zapobiec zmianie składu próbki, zanieczyszczeniu lub sfałszowaniu, które mogą nastąpić w czasie transportu lub przechowywania.

9.4.1. Substancje rozmieszczone jednolicie

W przypadku kontroli składników lub substancji jednolicie rozmieszczonych w paszy próbka zbiorcza może zostać w sposób reprezentatywny zredukowana do co najmniej 2,0 kg lub 2,0 litrów (próbka zredukowana) (3), w miarę możliwości przy użyciu rozdzielacza mechanicznego lub automatycznego. W przypadku pobierania próbek nasion roślin strączkowych, ziaren zbóż i orzechów z drzew orzechowych w celu kontroli pozostałości pestycydów minimalna wielkość próbki zredukowanej wynosi 3 kg. Jeżeli charakter paszy nie zezwala na zastosowanie rozdzielacza lub rozdzielacz nie jest dostępny, próbka może zostać zredukowana metodą ćwiartowania.

Z próbki zbiorczej lub próbek zredukowanych pobiera się próbki końcowe (do celów kontroli i obrony oraz ewentualnie do celów referencyjnych), które mają w przybliżeniu tę samą wielkość i są zgodne z ilościowymi wymaganiami określonymi w pkt 7.

9.4.2. Substancje rozmieszczone niejednolicie

W przypadku kontroli składników, w tym materiału zmodyfikowanego genetycznie, lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy, próbka zbiorcza musi zostać:

(i)	całkowicie zhomogenizowana. Ze zhomogenizowanej próbki zbiorczej pobiera się następnie próbki końcowe (do celów kontroli i obrony oraz ewentualnie do celów referencyjnych), które mają w przybliżeniu tę samą wielkość i są zgodne z ilościowymi wymaganiami określonymi w pkt 7; lub

(ii)

zredukowana do co najmniej 2 kg lub 2 litrów (4) przy użyciu rozdzielacza mechanicznego lub automatycznego. Jedynie w przypadku gdy charakter paszy nie zezwala na zastosowanie rozdzielacza, w razie potrzeby próbka może zostać zredukowana metodą ćwiartowania. Do celów kontroli występowania materiału genetycznie zmodyfikowanego zgodnie z rozporządzeniem (UE) nr 619/2011 próbka zredukowana musi zawierać co najmniej 35 000 nasion/ziaren, tak aby umożliwić uzyskanie próbek końcowych - do celów kontroli przestrzegania przepisów i obrony oraz ewentualnie do celów referencyjnych - zawierających co najmniej 10 000 nasion/ziaren (zob. przypis (**) w pkt 6 i przypis (*) w pkt 7).

Z próbki zredukowanej pobiera się próbki końcowe, które mają w przybliżeniu tę samą wielkość i są zgodne z ilościowymi wymaganiami określonymi w pkt 7.

9.5. Opakowanie próbek

Pojemniki lub opakowania są zapieczętowane i opatrzone etykietą w sposób uniemożliwiający otwarcie bez zniszczenia pieczęci. Całość etykiety musi być opieczętowana. Ewentualnie próbka może zostać umieszczona w pojemniku, który może być zamknięty w sposób uniemożliwiający jego ponowne otwarcie bez nieodwracalnego uszkodzenia pojemnika, co zapobiega jego ponownemu użyciu.

9.6. Wysyłka próbek do laboratorium

Próbkę wysyła się bezzwłocznie do wyznaczonego laboratorium analitycznego wraz z informacjami niezbędnymi dla analityka.

10. PROTOKÓŁ POBIERANIA PRÓBEK

Po każdym pobraniu próbek należy sporządzić protokół umożliwiający jednoznaczną identyfikację każdej kontrolowanej części i jej wielkości.

W protokole zapisuje się również wszelkie przypadki odejścia od metody pobierania próbek przewidzianej w niniejszym rozporządzeniu.

Oprócz udostępnienia protokołu urzędowemu laboratorium kontrolnemu zostaje on również udostępniony podmiotowi działającemu na rynku pasz i/lub laboratorium wyznaczonemu przez ten podmiot.

11. PRÓBKA PASZY SPRZEDAWANEJ NA ODLEGŁOŚĆ

-

W odniesieniu do próbki paszy sprzedawanej na odległość podmiot działający na rynku pasz proszony jest o przekazanie określonej ilości paszy za pomocą środków porozumiewania się na odległość. W takim przypadku występując o paszę, właściwy organ nie musi ujawniać podmiotowi działającemu na rynku pasz swojej urzędowej tożsamości i może wykorzystać inną tożsamość do jej ukrycia.

-

Próbka zbiorcza i próbki końcowe z próbki paszy sprzedawanej na odległość muszą zostać pobrane niezwłocznie po otrzymaniu przesyłki przez osoby upoważnione do tego celu. W celu wytworzenia próbki zbiorczej należy pobrać próbki pierwotne w sposób losowy i równomierny z całkowitej otrzymanej ilości oraz starannie je wymieszać lub poddać homogenizacji, w miarę możliwości zgodnie z zasadami ustanowionymi w pkt 5 oraz w pkt 9.2 i 9.3. Jeżeli pasza jest pakowana w pojedyncze jednostki, należy uzyskać co najmniej 4 jednostki, z których należy pobrać co najmniej jedną próbkę pierwotną. Jeżeli zostanie wykazane w poszczególnych przypadkach, że otrzymane jednostki pochodzą z różnych partii, należy zmniejszyć liczbę jednostek, z których pobiera się próbki, i ograniczyć ją do jednostek pochodzących z tej samej partii. W przypadku analizy próbki paszy sprzedawanej na odległość pod kątem składników lub substancji, które są niejednolicie rozmieszczone w paszy, liczba próbek pierwotnych musi być co najmniej 2,5 razy wyższa niż w przypadku próbek analizowanych pod kątem substancji równomiernie rozmieszczonych w paszy. Następnie z próbki zbiorczej pobiera się odpowiednie próbki końcowe (do celów kontroli i obrony oraz ewentualnie do celów referencyjnych), w miarę możliwości zgodnie z zasadami ustanowionymi w pkt 9.4, a protokół pobierania próbek wskazuje, że próbka jest próbką paszy sprzedawanej na odległość. Właściwy organ niezwłocznie informuje podmiot działający na rynku pasz o pobraniu próbek. Podmiot działający na rynku pasz powiadamia się również, że jedna próbka (do celów obrony) jest w miarę możliwości przechowywana w określonym miejscu do jego dyspozycji przez właściwy organ, do celów obrony, lub wysyłana do podmiotu działającego na rynku pasz lub do laboratorium wyznaczonego przez podmiot działający na rynku pasz zgodnie z obowiązującymi przepisami krajowymi. Jeżeli próbka jest wysyłana bezpośrednio do laboratorium urzędowego, próbka końcowa musi zostać przygotowana i zapieczętowana w laboratorium przez osoby upoważnione do tego celu lub w obecności osób upoważnionych do tego celu. Protokół pobierania próbek paszy sprzedawanej na odległość należy przesłać niezwłocznie po sporządzeniu próbek końcowych do właściwego organu, który informuje podmiot działający na rynku pasz o pobraniu próbek. Uważa się, że ilość dostarczona właściwemu organowi przez podmiot działający na rynku pasz stanowi część partii paszy tej samej klasy lub o tym samym opisie. Zgodnie z art. 15 rozporządzenia (WE) nr 178/2002 Parlamentu Europejskiego i Rady (5), jeżeli ta część partii została zidentyfikowana jako niespełniająca wymogów UE, zakłada się, również w przypadku próbki paszy sprzedawanej na odległość, że dotyczy to całej paszy w tej partii, chyba że po przeprowadzeniu szczegółowej oceny (w stosownych przypadkach podczas kontroli na miejscu) nie ma dowodów na to, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

„ZAŁĄCZNIK II

PRZEPISY OGÓLNE DOTYCZĄCE METODYKI ANALIZY PASZ

A. PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY

1. Cel

Procedury opisane w niniejszym załączniku dotyczą przygotowania do badań próbek przesyłanych do laboratoriów kontrolnych po pobraniu zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I.

Próbki laboratoryjne muszą być przygotowane w taki sposób, aby odważone ilości, jak przewidziano w metodyce analizy, były homogeniczne i reprezentatywne w odniesieniu do próbek końcowych.

Oprócz procedur opisanych w niniejszym załączniku należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi przygotowywania próbek przewidzianymi w normie EN ISO 6498.

2. Niezbędne środki ostrożności

Wybór procedury przy przygotowaniu próbek zależy od stosowanej metodyki analizy oraz składników lub substancji, które mają zostać poddane kontroli. Z tego względu bardzo ważne jest, by wybrana procedura przygotowania próbki była właściwa w odniesieniu do stosowanej metody analizy oraz składników lub substancji, które mają zostać poddane kontroli.

Wszystkie konieczne czynności należy wykonywać w taki sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zmianie składu próbki do badań.

Mielenie, mieszanie i przesiewanie należy wykonywać bezzwłocznie, przy ograniczonym dostępie powietrza i światła do próbki. Nie należy stosować młynków i rozdrabniarek, które podczas pracy powodują znaczące nagrzewanie próbki do badań.

W przypadku pasz szczególnie wrażliwych na ciepło zaleca się ręczne rozdrabnianie. Ponadto zastosowany sprzęt nie może stanowić źródła zanieczyszczenia.

Wykazano, że homogenizacja próbki polegająca na przygotowaniu zawiesiny poprzez wymieszanie z wodą w mieszalniku szybkoobrotowym pozwala uzyskać w niektórych przypadkach bardziej jednorodne podpróbki niż w przypadku homogenizacji/mielenia na sucho, w szczególności w przypadku niejednorodnie rozmieszczonych substancji chemicznych. Homogenizacja poprzez wystarczające mielenie na sucho może jednak również zapewnić jednorodne podpróbki.

W niektórych przypadkach, np. w celu oznaczenia sporyszu żyta, szkodliwych zanieczyszczeń botanicznych itp., homogenizacji próbki nie można dokonać poprzez mielenie, lecz przez wystarczające zmieszanie próbki.

Jeżeli przygotowanie próbki nie może być przeprowadzone bez znacznych zmian poziomu jej wilgotności, poziom ten oznacza się przed przygotowaniem i po przygotowaniu próbki zgodnie z metodą, o której mowa w załączniku III część A.

3. Sposób postępowania

3.1. Procedura ogólna

Podwielokrotność do badań pobiera się ze zhomogenizowanej próbki końcowej. Stożkowanie i dzielenie na ćwiartki nie są zalecane, ponieważ może to skutkować podwielokrotnościami do badań o dużym błędzie podziału.

3.1.1. Pasze, które mogą być zmielone

-	Próbkę końcową wymieszać oraz zgromadzić w odpowiednim czystym, suchym pojemniku, wyposażonym w szczelny korek. Wymieszać ponownie w celu zagwarantowania pełnej homogenizacji bezpośrednio przed odważeniem ilości przeznaczonej do analizy (podwielokrotności do badań).

3.1.2. Pasze, które mogą być zmielone po wysuszeniu

-

Jeśli nie ustalono inaczej w metodyce analizy, wysuszyć próbkę końcową w celu obniżenia jej poziomu wilgotności do 8-12 %, zgodnie z procedurą wstępnego suszenia opisaną pkt 4.3 metodyki oznaczania wilgotności, o której mowa w załączniku III część A. Następnie postępować zgodnie z procedurą wskazaną w pkt 3.1.1.

3.1.3. Pasze płynne lub półpłynne

-	Próbkę końcową umieścić w odpowiednim, czystym i suchym pojemniku, wyposażonym w szczelny korek. Wymieszać dokładnie w celu zagwarantowania pełnej homogenizacji bezpośrednio przed odważeniem ilości przeznaczonej do analizy (podwielokrotności do badań).

3.1.4. Inne pasze

-	Próbki końcowe, które nie mogą być przygotowane zgodnie z jedną z powyższych procedur, należy przygotować w taki sposób, aby odważone ilości wymagane do analizy (podwielokrotność do badań) były homogeniczne i reprezentatywne dla próbki końcowej.

3.2. Procedura szczególna w przypadku badania w drodze kontroli wzrokowej lub mikroskopowej lub w przypadku gdy cała próbka zbiorcza jest zhomogenizowana

-	W przypadku badania w drodze kontroli wzrokowej (bez mikroskopu) do badania stosuje się całą próbkę zbiorczą lub końcową.

-

W przypadku badania mikroskopem laboratorium może zredukować próbkę zbiorczą lub zredukować próbkę zredukowaną. Próbki końcowe do celów obrony oraz ewentualnie do celów referencyjnych pobiera się zgodnie z procedurą równoważną procedurze pobierania próbek w odniesieniu do próbki końcowej w celu kontroli przestrzegania przepisów.

-	Jeżeli cała próbka zbiorcza jest zhomogenizowana, próbki końcowe pobiera się ze zhomogenizowanej próbki zbiorczej.

-

W celu oznaczenia sporyszu żyta i szkodliwych zanieczyszczeń botanicznych próbkę końcową należy podzielić na dwie podpróbki o równej masie około 500 gramów. Bada się jedną podpróbkę. W przypadku gdy wynik z podpróbek jest równy lub niższy niż 50 % (próg analityczny) najwyższego dopuszczalnego poziomu, próbka jest zgodna z najwyższym dopuszczalnym poziomem. Jeżeli wynik przekracza 50 % najwyższego dopuszczalnego poziomu, należy zbadać inną podpróbkę i wykorzystać średnią wyników z dwóch podpróbek do sprawdzenia zgodności z najwyższym dopuszczalnym poziomem.

4. Przechowywanie próbek

Próbki należy przechowywać w temperaturze, która nie spowoduje zmiany ich składu. Próbki przeznaczone do badania witamin lub substancji, które są szczególnie wrażliwe na światło, należy przechowywać w warunkach gwarantujących, że światło nie wywrze na nie niekorzystnego wpływu.

B. PRZEPISY DOTYCZĄCE ODCZYNNIKÓW I APARATURY UŻYWANEJ W METODYCE ANALIZY

1.

Jeżeli w metodyce analizy nie ustalono inaczej, wszystkie stosowane odczynniki muszą mieć stopień czystości do analizy. W przypadku analizy śladowej czystość odczynników należy sprawdzić przez wykonanie próby ślepej. Zależnie od uzyskanych wyników może być konieczne dalsze oczyszczanie odczynników.

2.

Jeżeli w metodyce analizy nie podano konkretnego rozpuszczalnika lub rozcieńczalnika, w przypadku czynności wymagających przygotowania roztworów, rozcieńczania, spłukiwania lub przemywania należy stosować wodę. Co do zasady należy stosować wodę demineralizowaną lub destylowaną. W szczególnych przypadkach wymienionych w metodyce analizy wodę należy oczyścić w specjalny sposób.

3.

Ze względu na aparaturę i sprzęt, które zwykle stosuje się w laboratoriach kontrolnych, w metodyce analizy wymienia się tylko tę aparaturę i sprzęt, które wymagają szczególnego zastosowania lub mają specjalny charakter. Wszystkie urządzenia muszą być czyste, zwłaszcza gdy są oznaczane bardzo małe ilości substancji.

C. STOSOWANIE METODYKI ANALIZY I WYRAŻANIE WYNIKÓW

1. Postępowanie ekstrakcyjne

W kilku metodach określono konkretne postępowanie ekstrakcyjne. Z reguły można zastosować inne postępowanie ekstrakcyjne niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie ma równoważną wydajność ekstrakcji w odniesieniu do analizowanej matrycy.

2. Postępowanie oczyszczające

W kilku metodach określono konkretne postępowanie oczyszczające. Z reguły można zastosować inne postępowanie oczyszczające niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie daje równoważne wyniki analityczne w odniesieniu do analizowanej matrycy.

3. Liczba oznaczeń

W przypadku analizy substancji niepożądanych, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia jest znacznie (o > 50 %) niższy niż wartość ustalona w specyfikacji, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest analiza powtórna (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Średnia z tych dwóch oznaczeń jest wykorzystywana do dalszej oceny.

W przypadku kontroli minimalnych lub najwyższych dopuszczalnych poziomów dodatków paszowych, jeżeli wyniki pierwszego oznaczenia przekraczają minimalny poziom lub są niższe od najwyższego dopuszczalnego poziomu, dodatkowe oznaczenia nie są konieczne, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest analiza powtórna (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Średnia z tych dwóch oznaczeń jest wykorzystywana do dalszej oceny.

W przypadku kontroli deklarowanej zawartości substancji lub składnika, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia potwierdza deklarowaną zawartość, tj. wyniki analizy mieszczą się w dopuszczalnym zakresie zmienności co do deklarowanej zawartości, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest analiza powtórna (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Średnia z dwóch oznaczeń jest wykorzystywana do dalszej oceny (średni wynik analizy mieści się lub nie mieści się w dopuszczalnym zakresie zmienności deklarowanej zawartości).

W niektórych przypadkach taki dopuszczalny zakres zmienności jest określony w przepisach, takich jak rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 767/2009 i (UE) 2019/4 (1).

4. Podawanie zastosowanych metod analizy w sprawozdaniu

W sprawozdaniu z analizy określa się zastosowaną metodykę.

5. Podawanie wyników analizy

Wynik analizy wyraża się w sposób podany w metodyce analizy, zawiera on odpowiednią liczbę cyfr znaczących i, jeżeli to konieczne, musi być korygowany do wilgotności próbki końcowej przed przygotowaniem.

Większość poziomów regulacyjnych (np. najwyższy dopuszczalny poziom, poziom minimalny) w prawodawstwie UE dotyczącym pasz ustala się w odniesieniu do paszy o wilgotności 12 %. W związku z tym w tych przypadkach, aby ocenić wynik analizy zmierzony w odniesieniu do próbki w porównaniu z poziomem regulacyjnym, wynik analityczny najpierw należy podzielić przez zawartość suchej masy w próbce (w %) pomnożoną przez 88, jak wskazano we wzorze:

gdzie:

Mc	:	wilgotność próbki (w %). 100 - Mc stanowi zatem zawartość suchej masy w próbce (w %).
Rana	:	wynik analizy zmierzony dla próbki
R12 %	:	wynik dla paszy o wilgotności 12 %; należy ocenić w odniesieniu do poziomu regulacyjnego.

Ponadto, jeżeli spełnione są następujące warunki:

-	wynik analizy jest znacznie (> 50 %) niższy lub wyższy, niż wskazują informacje/specyfikacje w ramach etykietowania, które mają być kontrolowane (w zależności od tego, czy informacje/specyfikacje w ramach etykietowania odnoszą się do najwyższego dopuszczalnego, czy minimalnego poziomu);

-

zawartość wilgoci w paszy, z której pobrano próbki, jest znana i można stwierdzić, że korekta pod kątem zawartości wilgoci nie zmieni oceny, wówczas, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości, a analiza służy jedynie sprawdzeniu zgodności z przepisami prawnymi, korekta pod kątem zawartości wilgoci może zostać pominięta (np. w przypadku braku specyfikacji lub poziomu regulacyjnego), chyba że jest to konieczne do interpretacji.

Jeżeli wynik analizy jest korygowany do zawartości wilgoci, odpowiednia niepewność pomiaru musi również zostać skorygowana w ramach tej samej procedury.

W przypadku oznaczania sporyszu żyta lub szkodliwych zanieczyszczeń botanicznych poprzez badanie wzrokowe/mikroskopowe korekta pod kątem zawartości wilgoci nie jest konieczna.

6. Niepewność pomiaru analitycznego i stopień odzysku w przypadku analizy substancji niepożądanych

W odniesieniu do substancji niepożądanych w rozumieniu dyrektywy 2002/32/WE Parlamentu Europejskiego i Rady uznaje się, że produkt przeznaczony do żywienia zwierząt jest niezgodny z ustaloną maksymalną zawartością, jeżeli wynik analizy wyrażony jako średnia dwóch niezależnych oznaczeń, w odniesieniu do paszy o wilgotności 12 %, wskazuje na przekroczenie maksymalnej zawartości, z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2, który daje poziom ufności około 95 %, i korekty o odzysk. Oznacza to, że badane stężenie po uwzględnieniu korekty o odzysk i odjęciu niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego od wyniku stanowi podstawę oceny zgodności. Procedura ta ma zastosowanie jedynie w przypadkach, gdy metoda analizy pozwala na ustalenie niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego i korekty o odzysk (np. nie jest wymagana w przypadku badania wzrokowego/mikroskopowego).

Jeżeli wynik analizy próbki pobranej do celów obrony przekracza maksymalną zawartość (bez uwzględnienia niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego), potwierdza to niezgodność ustaloną w przypadku próbki kontrolnej, przy braku szczegółowych przepisów krajowych w tym zakresie.

Wynik analizy przedstawia się w sposób następujący (o ile stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego):

a)

skorygowany o odzysk, w stosownych przypadkach, wraz z informacją o korekcie, jeśli miała ona miejsce. Należy podać stopień odzysku, chyba że wewnętrzna korekta z tytułu obciążenia metody jest częścią procedury, przy czym obciążenie metody jest różnicą między zmierzoną wartością a stężeniem odniesienia. Korekta o odzysk nie jest konieczna, jeśli stopień odzysku wynosi 90-110 %;

b)	jako »x +/- U«, gdzie x oznacza wynik analizy, a U - niepewność rozszerzoną pomiaru analitycznego, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2 (2), co daje wynik na poziomie ufności ok. 95 %.

Jeżeli wynik analizy jest jednak znacznie (o > 50 %) niższy niż objęta kontrolą wartość ustalona w specyfikacji oraz pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości, a analiza wykonywana jest jedynie do celów sprawdzenia zgodności z przepisami prawnymi, informacje na temat stopnia odzysku i niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego można pominąć (np. w przypadku braku specyfikacji lub poziomu regulacyjnego), chyba że niepewność pomiaru jest konieczna do interpretacji.

7. Niepewność pomiaru analitycznego i stopień odzysku w przypadku analizy zawartości dodatków paszowych

W celu sprawdzenia zgodności z dozwoloną minimalną i maksymalną zawartością dodatków paszowych obecność dodatku paszowego uznaje się za niezgodną z ustaloną zawartością minimalną i maksymalną, jeżeli wynik analizy wyrażony jako średnia dwóch niezależnych oznaczeń w odniesieniu do paszy o wilgotności 12 % wskazuje na:

-

przekroczenie maksymalnej zawartości, z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego i korekty o odzysk. Oznacza to, że badane stężenie (tj. średnia z dwóch oznaczeń) po uwzględnieniu korekty o odzysk i odjęciu niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego od wyniku stanowi podstawę oceny zgodności.

-

wartość niższą od minimalnej zawartości, z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego i korekty o odzysk. Oznacza to, że badane stężenie (tj. średnia z dwóch oznaczeń) po uwzględnieniu korekty o odzysk i dodaniu niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego do wyniku stanowi podstawę oceny zgodności.

Jeżeli wynik analizy próbki pobranej do celów obrony przekracza maksymalną zawartość (bez uwzględnienia niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego), potwierdza to niezgodność ustaloną w przypadku próbki kontrolnej, przy braku szczegółowych przepisów krajowych w tym zakresie.

Wynik analizy przedstawia się w sposób następujący (o ile stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności rozszerzonej pomiaru analitycznego):

a)

skorygowany o odzysk, w stosownych przypadkach, wraz z informacją o korekcie, jeśli miała ona miejsce. Należy podać stopień odzysku, chyba że wewnętrzna korekta z tytułu obciążenia metody jest częścią procedury, przy czym obciążenie metody jest różnicą między zmierzoną wartością a stężeniem odniesienia. Korekta o odzysk nie jest konieczna, jeśli stopień odzysku wynosi 90-110 %;

b)	jako »x +/- U«, gdzie x oznacza wynik analizy (średnia z dwóch oznaczeń), a U - niepewność rozszerzoną pomiaru analitycznego, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia 2 (3), co daje wynik na poziomie ufności ok. 95 %.

„ZAŁĄCZNIK III

METODY ANALIZY SKŁADU MATERIAŁÓW I MIESZANEK PASZOWYCH

A. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania wilgotności pasz. Należy zauważyć, że w przypadku pasz zawierających substancje lotne, np. kwasy organiczne, podczas oznaczania wilgotności oznaczana jest również znaczna liczba substancji lotnych.

Metody nie stosuje się do badania produktów mlecznych występujących jako materiały paszowe oraz mieszanek paszowych złożonych głównie z produktów mlecznych, a także badania tłuszczów i olejów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego oraz nasion i owoców oleistych.

Oznaczanie zawartości wilgoci w nasionach oleistych należy przeprowadzać za pomocą metody przewidzianej w normie EN ISO 665 - Oznaczanie zawartości wilgoci i substancji lotnych, przy założeniu, że nasiona soi muszą być zmielone przed określeniem zawartości wilgoci.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w warunkach dostosowanych do właściwości pasz. Ubytek masy jest określany metodą wagową. Jeżeli pasze stałe mają wysoką zawartość wilgoci, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego suszenia.

3. Aparatura i sprzęt

3.1.

Rozdrabniarka z materiału nieabsorbującego wilgoci, łatwa do czyszczenia, i umożliwiająca szybkie i równomierne rozdrabnianie bez wytwarzania znacznych ilości ciepła, uniemożliwiająca kontakt z powietrzem z zewnątrz, na ile jest to możliwe, i spełniająca wymagania podane w pkt 4.1.1 i 4.1.2 (np. mikrorozdrabniarki młotkowe lub chłodzone wodą, składane młynki stożkowe, rozdrabniarki powolne lub z walcami uzębionymi)

3.2.

Waga analityczna ważąca z dokładnością do 1 mg

3.3.

Suche pojemniki z nierdzewnego metalu lub ze szkła z przykrywkami umożliwiającymi hermetyczne zamknięcie, o powierzchni roboczej umożliwiającej równomierne rozprowadzenie badanej próbki w warstwie 0,3 g/cm2

3.4.

Suszarka elektryczna termostatowana (± 2 °C), dobrze wentylowana i pozwalająca na szybką regulację temperatury (1)

3.5.

Suszarka próżniowa elektrycznie ogrzewana z regulacją temperatury zaopatrzona w pompę olejową oraz mechanizm umożliwiający nawiew gorącego suchego powietrza lub wprowadzenie środka suszącego (np. tlenku wapnia).

3.6.

Eksykator z płytką z grubego perforowanego metalu lub porcelany, zawierający efektywny środek suszący.

4. Sposób postępowania

Uwaga:

Czynności opisane w tej części należy wykonywać natychmiast po otworzeniu opakowania próbki. Analizę należy wykonać co najmniej dwukrotnie.

4.1. Przygotowanie

4.1.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.1.2 i 4.1.3

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Jeżeli to konieczne, rozdrobnić lub podzielić w taki sposób, aby zapobiec jakimkolwiek zmianom zawartości wilgoci (zob. pkt 6).

4.1.2. Zboża i kasze

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Rozdrobnić na cząstki, które przechodzą przez oczka sita o średnicy 0,5 mm co najmniej w 50 % i pozostają w ilości nie wyższej niż 10 % na sicie o oczkach o średnicy 1 mm.

4.1.3. Pasze płynne lub w postaci pasty, pasze z przewagą olejów lub tłuszczów

Pobrać około 25 g próbki, zważyć z dokładnością do 10 mg, dodać odpowiednią ilość wysuszonego piasku odważonego z dokładnością do 10 mg i zmieszać do uzyskania jednorodnego produktu.

4.2. Suszenie

Wysuszyć pojemnik (pkt 3.3) z przykrywką w suszarce ustawionej na temperaturę 103 °C przez 30 min ± 1 min. Wyjąć z suszarki i pozostawić do schłodzenia do temperatury otoczenia w eksykatorze (pkt 3.6).

4.2.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.2.2 i 4.2.3

Zważyć pojemnik razem z przykrywką z dokładnością do 1 mg. Do zważonego pojemnika odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić pojemnik bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 103 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić pojemnik w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez cztery godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 103 °C. Otworzyć suszarkę, natychmiast nałożyć przykrywkę na pojemnik, wyjąć go z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30-45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

Pasze z przeważającym (> 50 %) udziałem olejów lub tłuszczów pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego suszyć ponownie w suszarce przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 103 °C. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.2.2. Zboża, mąki, kasze i mączki

Zważyć pojemnik razem z przykrywką z dokładnością do 0,5 mg. Do zważonego pojemnika odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g rozdrobnionej próbki i równo rozmieścić. Wstawić pojemnik bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 130 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić pojemnik w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez dwie godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 130 °C. Otworzyć suszarkę, natychmiast nałożyć przykrywkę na pojemnik, wyjąć go z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30-45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

4.2.3. Mieszanki paszowe zawierające ponad 4 % sacharozy lub laktozy: materiały paszowe, takie jak chleb świętojański, hydrolizowane produkty zbożowe, słód jęczmienny, susz buraczany, hydrolizaty rybne i cukrowe

Zważyć pojemnik razem z przykrywką z dokładnością do 0,5 mg. Do zważonego pojemnika odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić pojemnik bez przykrywki do suszarki próżniowej (pkt 3.5) podgrzanej do temperatury od 80 do 85 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić pojemnik w suszarce tak szybko, jak to możliwe.

Podwyższyć ciśnienie do 100 Torr i pozostawić w celu wysuszenia na cztery godziny pod działaniem tego ciśnienia, w strumieniu gorącego, suchego powietrza albo stosując środek suszący (ok. 300 g na 20 próbek). W drugim przypadku odłączyć pompę próżniową po uzyskaniu odpowiedniego ciśnienia. Czas suszenia liczyć od chwili, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę od 80 do 85 °C. Ostrożnie zrównać ciśnienie w suszarce z ciśnieniem atmosferycznym. Otworzyć suszarkę, natychmiast nałożyć przykrywkę na pojemnik, wyjąć go z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30-45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć ponownie w suszarce próżniowej przez 30 minut o temperaturze od 80 do 85 °C i zważyć powtórnie. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.3. Wstępne (częściowe) suszenie

»Mokre« pasze o ułamku masowym wynoszącym mniej niż 85 % suchej masy (np. zielonki, całkowicie wymieszane dawki (TMR), pasza (inna niż) płynna) należy przed mieleniem na drobno poddać częściowemu suszeniu w celu przeanalizowania ich stabilnych substancji; w przypadku substancji niestabilnych częściowe suszenie nie jest możliwe.

Częściowe suszenie może być przeprowadzane przy użyciu suszarki z wymuszonym obiegiem powietrza lub kuchenki mikrofalowej, lub poprzez liofilizację. Z wyjątkiem częściowego suszenia w drodze liofilizacji paszę należy suszyć przy jednoczesnym utrzymaniu temperatury próbki poniżej 60 °C, tak aby w minimalnym stopniu wpłynąć na skład chemiczny. Suszenie w temperaturach wyższych niż 60 °C powoduje zmiany chemiczne w paszy (np. degradacja białka). Suszona pasza jest pozostawiona w temperaturze pokojowej przez około 15 minut przed pomiarem częściowej suchej masy, tak aby zminimalizować potencjalną zmianę wilgotności, jaka może wystąpić podczas mielenia i przechowywania. Suszenie w temperaturach niższych niż 60 °C nie usuwa całej wody z paszy; w związku z tym (początkowe) częściowe suszenie nie pozwala oznaczyć całkowitej suchej masy paszy. Po suszeniu podpróbkę mieli się i analizuje pod kątem (końcowej) suchej masy częściowo wysuszonej próbki (pozostałe 3-15 % wilgoci) przy oznaczaniu innych składników chemicznych.

W związku z tym zaleca się dwuetapową procedurę oznaczania suchej masy. Najpierw należy oznaczyć częściową zawartość suchej masy (jeżeli ma wartość niższą niż 85 % suchej masy), a następnie oznaczyć pozostałą zawartość suchej masy na zmielonej próbce badanej i pomnożyć częściową suchą masę przez pozostałą suchą masę w celu oznaczenia całkowitej zawartości suchej masy.

5. Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następujących wzorów:

5.1. Suszenie bez suszenia wstępnego

gdzie:

m	=	początkowa masa w gramach badanej próbki
m0	=	masa w gramach badanej próbki po wysuszeniu

5.2. Suszenie z suszeniem wstępnym (2)

gdzie:

m	=	początkowa masa w gramach badanej próbki
m1	=	masa w gramach badanej próbki po wstępnym suszeniu
m2	=	masa w gramach badanej próbki po rozdrobnieniu lub zmieleniu
m0	=	masa w gramach badanej próbki po wysuszeniu

5.3. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,2 % bezwzględnej wartości wilgotności, z wyjątkiem wilgotnej karmy dla zwierząt domowych i gryzaków dla psów, w przypadku których różnica nie przekracza 0,5 % bezwzględnej wartości wilgotności.

6. Objaśnienia

Jeżeli rozdrabnianie próbki jest konieczne i wpływa na zawartość wilgoci w produkcie, wyniki analizy składników paszy należy skorygować w oparciu o poziom wilgotności w początkowym stanie próbki.

B. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI OLEJÓW I TŁUSZCZÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO I ROŚLINNEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wody i substancji lotnych w tłuszczach i olejach pochodzenia zwierzęcego oraz roślinnego.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w temperaturze 103 °C do uzyskania stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami musi wynosić 1 mg lub mniej). Ubytek masy jest określany metodą wagową.

3. Aparatura i sprzęt

3.1.

Naczynie z płaskim dnem wykonane z materiału nierdzewnego, o średnicy od 8 do 9 cm i wysokości około 3 cm

3.2.

Termometr rtęciowy ze wzmocnionym zbiornikiem i ekspansyjną rurką w górnym końcu, z podziałką od 80 do co najmniej 110 °C i o długości około 10 cm

3.3.

Łaźnia piaskowa lub elektryczna płyta grzejna

3.4.

Eksykator zawierający efektywny środek suszący

3.5.

Waga analityczna

4. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 20 g zhomogenizowanej próbki do suchego, zważonego naczynia (pkt 3.1), zawierającego termometr (pkt 3.2). Ogrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzejnej (pkt 3.3), ciągle mieszając termometrem, tak aby uzyskać wzrost temperatury do 90 °C w czasie około 7 minut.

Zmniejszyć ogrzewanie, obserwując częstotliwość odrywania się pęcherzyków powietrza od dna naczynia. Temperatura nie może przekroczyć 105 °C. Kontynuować mieszanie, pocierając dno naczynia do czasu, aż przestaną się tworzyć pęcherzyki.

W celu całkowitego odparowania wilgoci należy ogrzewać próbkę kilka razy do temperatury 103 °C ± 2 °C, schładzając do 93 °C pomiędzy kolejnymi ogrzewaniami. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej w eksykatorze (pkt 3.4) i zważyć. Powtarzać czynności, dopóki ubytek masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie większy niż 2 mg.

Uwaga

Wzrost masy próbki po powtórnym ogrzewaniu wskazuje na utlenienie się tłuszczu. W takim przypadku do obliczenia wyniku wziąć masę próbki z ważenia przed wzrostem jej masy.

5. Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m	=	masa w gramach badanej próbki
m1	=	masa w gramach naczynia z zawartością przed ogrzewaniem
m2	=	masa w gramach naczynia z zawartością po ogrzewaniu

Wyniki oznaczania niższe niż 0,05 % należy zapisać, używając określenia »niższe niż 0,05 %«.

Powtarzalność

Różnica wilgotności pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,1 % w wartości bezwzględnej.

C. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI AZOTU I OBLICZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości białka surowego w paszy na podstawie zawartości azotu oznaczonego metodą Kjeldahla (3).

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Kwaśny roztwór jest alkalizowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu. Amoniak destyluje się i zbiera w znanej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany roztworem wzorcowym wodorotlenku sodu.

Ewentualnie uwolniony amoniak jest destylowany do nadmiaru roztworu kwasu borowego, a następnie miareczkowany roztworem kwasu chlorowodorowego lub siarkowego.

3. Odczynniki

3.1.

Siarczan potasu

3.2.

Katalizator: tlenek miedzi(II) CuO lub pentahydrat siarczanu miedzi(II), CuSO4 5H2O

3.3.

Granulowany cynk

3.4.

Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5.

Kwas siarkowy, roztwór mianowany, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6.

Kwas siarkowy, roztwór mianowany, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7.

Kwas siarkowy, roztwór mianowany, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8.

Czerwień metylowa, wskaźnik: rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.

Roztwór wodorotlenku sodu (może być techniczny), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Wodorotlenek sodu, roztwór mianowany c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11.

Wodorotlenek sodu, roztwór mianowany c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12.

Granulowany kamień pumeksowy, przemyty kwasem chlorowodorowym i wyprażony

3.13.

Acetanilid (temperatura topnienia = 114 °C, zawartość N = 10,36 %)

3.14.

Sacharoza (niezawierająca azotu)

3.15.

Kwas borowy (H3BO3)

3.16.

Roztwór czerwieni metylowej, wskaźnik: rozpuścić 100 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu lub metanolu.

3.17.

Roztwór zieleni bromokrezolowej: rozpuścić 100 mg zieleni bromokrezolowej w 100 ml etanolu lub metanolu.

3.18.

Roztwór kwasu borowego (od 10 g/l do 40 g/l, w zależności od stosowanej aparatury i sprzętu). Przy stosowaniu kolorymetrycznego wyznaczania punktu końcowego do roztworów kwasu borowego należy dodać wskaźniki czerwieni metylowej i zieleni bromokrezolowej. Jeżeli przygotowuje się 1 l roztworu kwasu borowego, przed dostosowaniem objętości należy dodać 7 ml roztworu czerwieni metylowej (pkt 3.16) i 10 ml roztworu zieleni bromokrezolowej (pkt 3.17). Odczyn pH roztworu kwasu borowego może różnić się między seriami w zależności od użytej wody. Odczyn pH roztworu kwasu borowego musi wynosić między 4,3 a 4,7. Często do uzyskania pozytywnej próby ślepej konieczne jest dostosowanie pH przy pomocy niewielkiej ilości zasady. Uwaga: Dodanie ok. 3-4 ml NaOH (pkt 3.11) do 1 l kwasu borowego o stężeniu 10 g/l zwykle zapewnia dobre dostosowanie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej oraz chronić przed światłem i źródłami oparów amoniaku.

3.19.

Kwas chlorowodorowy, roztwór mianowany o stężeniu c(HCl) = 0,10 mol/l Uwaga: można zastosować inne stężenia roztworów wolumetrycznych (pkt 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 i 3.19), jeżeli zostanie to uwzględnione w obliczeniach. Stężenie należy podawać zawsze z dokładnością do czterech miejsc po przecinku.

4. Aparatura i sprzęt

Aparatura i sprzęt odpowiedni do przeprowadzenia mineralizacji, destylacji i miareczkowania według metody Kjeldahla

5. Sposób postępowania

5.1. Mineralizacja

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1 g próbki i przenieść do kolby aparatu do mineralizacji. Dodać 15 g siarczanu potasu (pkt 3.1), odpowiednią ilość katalizatora (pkt 3.2) (od 0,3 do 0,4 g tlenku miedzi(II) lub od 0,9 do 1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi(II)), 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.4) oraz, w razie potrzeby, kilka granulek kamienia pumeksowego (pkt 3.12) i zamieszać.

Początkowo ogrzewać kolbę ostrożnie, w razie konieczności mieszając od czasu do czasu, aż do zwęglenia substancji i zaniku piany; następnie zwiększyć intensywność ogrzewania aż do trwałego wrzenia roztworu. Ogrzewanie jest właściwe, jeżeli wrzący kwas kondensuje się na ściankach kolby. Zapobiegać przegrzewaniu się ścianek i przylepianiu do nich organicznych cząstek.

Od chwili gdy roztwór stanie się klarowny i przyjmie jasnozieloną barwę, kontynuować ogrzewanie przez dwie godziny, a następnie pozostawić do schłodzenia.

5.2. Destylacja

Ostrożnie dodać do kolby ilość wody wystarczającą do całkowitego rozpuszczenia siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie w razie potrzeby dodać kilka granulek cynku (pkt 3.3). Postępować zgodnie z pkt 5.2.1 lub 5.2.2.

5.2.1. Destylacja do kwasu siarkowego

Umieścić w odbieralniku aparatu destylacyjnego odmierzone 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.5 lub 3.7), zależnie od przewidywanej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (pkt 3.8).

Podłączyć kolbę mineralizacyjną do chłodnicy aparatu destylacyjnego i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w kolbie odbieralnika na głębokość co najmniej 1 cm (zob. objaśnienia pkt 8.3). Powoli wlać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.9) do kolby mineralizacyjnej, nie dopuszczając do strat amoniaku (zob. objaśnienia pkt 8.1). Ogrzewać kolbę aż do całkowitego oddestylowania amoniaku.

5.2.2. Destylacja do kwasu borowego

Jeżeli miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie wykonywane jest ręcznie, zastosowanie ma poniższe postępowanie. Jeżeli aparat destylacyjny jest w pełni zautomatyzowany i obejmuje miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie, należy stosować się do instrukcji producenta aparatu.

Umieścić kolbę odbieralnika zawierającą od 25 do 30 ml roztworu kwasu borowego (pkt 3.18) pod ujściem chłodnicy w taki sposób, aby rurka doprowadzająca znajdowała się pod powierzchnią nadmiaru roztworu kwasu borowego. Ustawić aparat destylacyjny, aby podał 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.9). Obsługiwać aparat destylacyjny zgodnie z instrukcjami producenta i oddestylować amoniak uwolniony w wyniku dodania roztworu wodorotlenku sodu. Zebrać destylat w roztworze kwasu borowego. Ilość destylatu (czas destylacji parą wodną) zależy od zawartości azotu w próbce. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta.

Uwaga:

W przypadku półautomatycznego aparatu destylacyjnego dodawanie nadmiaru wodorotlenku sodu i destylacja parą wodną przeprowadzane są automatycznie.

5.3. Miareczkowanie

Postępować zgodnie z pkt 5.3.1 lub 5.3.2.

5.3.1. Kwas siarkowy

Miareczkować nadmiar kwasu siarkowego w kolbie odbieralnika roztworem wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11), w zależności od stężenia zastosowanego kwasu siarkowego, do uzyskania punktu końcowego.

5.3.2. Kwas borowy

Miareczkować zawartość kolby odbieralnika roztworem mianowanym kwasu chlorowodorowego (pkt 3.19) lub kwasu siarkowego (pkt 3.6) przy pomocy biurety i odczytać ilość zużytego titrantu.

Przy stosowaniu kolorymetrycznego wyznaczania punktu końcowego punkt końcowy osiąga się w momencie pojawienia się pierwszego śladu różowego zabarwienia zawartości. Określić odczyt biurety z dokładnością do 0,05 ml. W wizualizacji punktu końcowego pomocna jest podświetlana płyta mieszadła magnetycznego lub detektor fotometryczny.

Można to przeprowadzić automatycznie za aparatury do destylacji z parą wodną z funkcją automatycznego miareczkowania.

Przy obsłudze konkretnego aparatu destylacyjnego lub aparatu do miareczkowania stosować się do instrukcji producenta.

Uwaga:

Jeżeli stosowany jest system automatycznego miareczkowania, rozpoczyna się ono bezpośrednio po rozpoczęciu destylacji i stosowany jest 1 % roztwór kwasu borowego (pkt 3.18).

Jeżeli stosowany jest w pełni automatyczny aparat destylacyjny, automatyczne miareczkowanie amoniaku można przeprowadzić również z wykryciem punktu końcowego przy pomocy potencjometrycznego systemu pH.

W tym przypadku stosowany jest automatyczny aparat do miareczkowania z pehametrem. Pehametr musi być odpowiednio skalibrowany w zakresie od pH 4 do pH 7 za pomocą zwykłych laboratoryjnych metod kalibracji pH.

Punkt końcowy pH w miareczkowaniu osiąga się przy wartości pH równej 4,6, co stanowi najwyższy punkt krzywej miareczkowania (punkt przegięcia).

5.4. Próba ślepa

W celu potwierdzenia, że zastosowane odczynniki nie zawierają azotu, przeprowadzić próbę ślepą (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (pkt 3.14) zamiast próbki.

6. Obliczanie wyników

Obliczenia wykonywane są zgodnie z pkt 6.1 lub 6.2.

6.1. Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.1

Zawartość białka surowego jako wartość procentowa masy obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

V0	=	objętość (ml) NaOH (pkt 3.10 lub 3.11) zużytego do próby ślepej
V1	=	objętość (ml) NaOH (pkt 3.10 lub 3.11) zużytego do miareczkowania próbki
c	=	stężenie (mol/l) wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11)
m	=	masa (g) próbki

6.2. Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.2

6.2.1. Miareczkowanie kwasem chlorowodorowym

Zawartość białka surowego jako wartość procentowa masy obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m	=	masa (g) naważki
c	=	stężenie (mol/l) roztworu mianowanego kwasu chlorowodorowego (pkt 3.19)
V0	=	objętość (w ml) kwasu chlorowodorowego użytego do próby ślepej
V1	=	objętość (w ml) kwasu chlorowodorowego użytego do naważki

6.2.2. Miareczkowanie kwasem siarkowym

Zawartość białka surowego jako wartość procentowa masy obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m	=	masa (g) naważki
c	=	stężenie (mol/l) roztworu mianowanego kwasu siarkowego (pkt 3.6)
V0	=	objętość (w ml) kwasu siarkowego (pkt 3.6) użytego do próby ślepej
V1	=	objętość (w ml) kwasu siarkowego (pkt 3.6) użytego do naważki

7. Sprawdzenie metody

7.1. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

-	0,4 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższej niż 20 %,

-	2,0 % względem wyższej wartości, dla zawartości białka surowego od 20 do 40 %,

-	0,8 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego wyższej niż 40 %.

7.2. Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach nie może przekraczać:

-	1,8 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższej niż 20 %,

-	9,0 % względem wyższej wartości, dla zawartości białka surowego od 20 do 40 %,

-	3,6 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego wyższej niż 40 %.

7.3. Dokładność

Przeprowadzić analizę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując odpowiednią ilość acetanilidu (pkt 3.13) (np. od 0,2 do 0,3 g) w obecności 1 g sacharozy (pkt 3.14); 1 g acetanilidu zużywa 14,80 ml kwasu siarkowego (pkt 3.5). Odzysk musi wynosić co najmniej 99 %.

8. Objaśnienia

8.1.

Sprzęt i aparatura mogą być obsługiwane ręcznie, półautomatycznie lub być całkowicie zautomatyzowane. W przypadku konieczności przeniesienia pomiędzy etapami mineralizacji i destylacji, czynność tę należy wykonać bez jakichkolwiek strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu natychmiast przed podłączeniem kolby do chłodnicy, wlewając ciecz powoli po ściankach.

8.2.

Jeżeli roztwór przechodzi w postać stałą, ponownie przeprowadzić oznaczanie, stosując większe ilości kwasu siarkowego (pkt 3.4) niż podano w pkt 5.1.

8.3.

W przypadku produktów o niskiej zawartości azotu objętość kwasu siarkowego (pkt 3.7), która ma zostać dodana do kolby odbieralnika, może być w miarę potrzeby zmniejszona do 10 lub 15 ml i uzupełniona wodą do objętości 25 ml.

8.4.

Do celów rutynowego badania można stosować inne metody analizy w odniesieniu do oznaczania białka surowego, ale metoda Kjeldahla opisana w niniejszej części C stanowi metodę referencyjną. Równoważność wyników uzyskanych inną metodą (np. DUMAS) w porównaniu z metodą referencyjną musi zostać wykazana odrębnie dla każdej matrycy. Ze względu na fakt, iż nawet po potwierdzeniu równoważności wyniki uzyskane inną metodą mogą się nieznacznie różnić od wyników uzyskanych metodą referencyjną, konieczne jest podanie w sprawozdaniu z analizy metody analitycznej zastosowanej do oznaczenia białka surowego.

D. OZNACZANIE MOCZNIKA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości mocznika stosowanego jako dodatek paszowy w paszach przeznaczonych dla przeżuwaczy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka ze środkiem klarującym tworzy w wodzie zawiesinę. Zawiesina jest filtrowana. Zawartość mocznika w filtracie jest oznaczana po dodaniu 4-dwumetyloaminobenzaldehydu (4-DMAB) poprzez pomiar gęstości optycznej przy długości fali 420 nm.

3. Odczynniki

3.1.

Roztwór 4-dwumetyloaminobenzaldehydu: rozpuścić 1,6 g 4-DMAB w 100 ml 96 % etanolu i dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (ρ20 1,19 g/ml). Trwałość tego odczynnika wynosi nie więcej niż dwa tygodnie.

3.2.

Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3.

Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu, K4Fe(CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4.

Aktywny węgiel nieabsorbujący mocznika (sprawdzony)

3.5.

Roztwór 0,1 % (w/v) mocznika

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Mikser (tumbler): ok. 35-40 obr./min

4.2.

Probówki: 160 × 16 mm ze szlifowanymi korkami szklanymi

4.3.

Spektrofotometr

5. Sposób postępowania

5.1. Analiza próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2 g próbki i umieścić razem z 1 g aktywnego węgla (pkt 3.4) w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody i 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.2), mieszać przez ok. 30 sekund, a następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.3). Mieszać przez 30 minut w tumblerze. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, wstrząsnąć i przefiltrować.

Do probówek ze szlifowanymi korkami szklanymi przenieść po 5 ml przezroczystego, bezbarwnego filtratu, dodać 5 ml roztworu 4-DMAB (pkt 3.1) i zamieszać. Wstawić probówki do łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 20 °C (+/- 4 °C). Po 15 minutach zmierzyć gęstość optyczną roztworu próbki spektrofotometrem przy długości fali 420 nm. Pomiar porównać z roztworem do badań ze ślepej próby odczynnikowej.

5.2. Krzywa wzorcowa

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml nalać 1, 2, 4, 5 i 10 ml roztworu mocznika (pkt 3.5) i uzupełnić do pełnej objętości kolb wodą. Odlać 5 ml każdego z roztworów, dodać do każdej kolby po 5 ml roztworu 4-DMAB (pkt 3.1), zhomogenizować i zmierzyć gęstość optyczną w podany wyżej sposób, porównując z roztworem kontrolnym zawierającym 5 ml 4-DMAB i 5 ml wody pozbawionej mocznika. Wykreślić krzywą wzorcową.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie krzywej wzorcowej oznaczyć zawartość mocznika w próbce.

Wynik należy wyrazić w mg mocznika na kg próbki.

7. Ocena metody

7.1. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki w tym samym laboratorium i przez tego samego analityka nie może przekraczać:

-	przy 420 nm - 50 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 5 000 mg/kg, - 25 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 5 000 mg/kg do niższej niż 7 000 mg/kg, - 20 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika 7 000 mg/kg lub wyższej,

-	przy 435 nm - 40 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 5 000 mg/kg, - 25 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 5 000 mg/kg do niższej niż 9 000 mg/kg, - 5 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika 9 000 mg/kg lub wyższej.

7.2. Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach lub przez różnych analityków nie może przekraczać:

-	przy 420 nm - 3 000 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 12 000 mg/kg, - 4 500 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości mocznika 12 000 mg/kg lub wyższej,

-	przy 435 nm - 50 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika od 3 000 mg/kg do niższej niż 8 000 mg/kg, - 25 % względem wyższej wartości, dla zawartości mocznika 8 000 mg/kg lub wyższej.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

Zorganizowano porównanie międzylaboratoryjne UE, w którym wzięło udział 18 laboratoriów. Zbadano pięć pozytywnych próbek mieszanek paszowych dla przeżuwaczy (MAT w tabelach 1 i 2) (1 analiza) ze ślepymi duplikatami, a jedna ślepa próbka mieszanki paszowej dla przeżuwaczy została zbadana raz.

Obliczenia wartości granicznych powtarzalności (r) i odtwarzalności (R), jak określono w wytycznych międzynarodowych, przeprowadzono po usunięciu wartości odstających przy użyciu analizy wariancji ważnych wartości.

Obliczone dane liczbowe dotyczące wydajności metody (powtarzalność, odtwarzalność) przedstawiono w tabelach poniżej. W odniesieniu do wszystkich badanych próbek, w tym ślepych, nie znaleziono wyników fałszywie pozytywnych ani wyników fałszywie negatywnych.

Tabela 1

Charakterystyka wydajności analitycznej dla mocznika zmierzona przy λ = 420 nm we wszystkich materiałach

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Owce	Bydło	Owce	Owce	Bydło
Docelowy ułamek masowy (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Średni ułamek masowy (mg kg-1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Odchylenie standardowe odtwarzalności sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Odchylenie standardowe powtarzalności sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Względne odchylenie standardowe odtwarzalności RSDR (%)	27	19	13	10	14
Względne odchylenie standardowe powtarzalności RSDr (%)	17	9	7	7	6
Granica odtwarzalności, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Granica powtarzalności, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabela 2

Charakterystyka wydajności analitycznej dla mocznika zmierzona przy λ = 435 nm we wszystkich materiałach

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Owce	Bydło	Owce	Owce	Bydło
Docelowy ułamek masowy (mg kg-1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Średni ułamek masowy (mg kg-1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Odchylenie standardowe odtwarzalności sR (mg kg-1)	706	1 194	675	745	1 378
Odchylenie standardowe powtarzalności sr (mg kg-1)	570	628	613	196	167
Względne odchylenie standardowe odtwarzalności RSDR (%)	17	18	9	7	12
Względne odchylenie standardowe powtarzalności RSDr (%)	14	10	8	2	1
Granica odtwarzalności, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Granica powtarzalności, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9. Objaśnienia

9.1.

W przypadku gdy zawartość mocznika jest wyższa niż 3 %, zmniejszyć masę próbki do 1 g lub rozcieńczyć pierwotny roztwór tak, aby w 500 ml nie znajdowało się więcej niż 50 mg mocznika.

9.2.

W przypadku niskiej zawartości mocznika zwiększać masę próbki na tyle, aby filtrat pozostał przezroczysty i bezbarwny.

9.3.

Powyższe wyniki porównań międzylaboratoryjnych nie wskazują na znaczącą różnicę precyzji między mocznikiem zmierzonym przy 420 nm lub 435 nm.

E. OZNACZANIE AMINOKWASÓW (Z WYJĄTKIEM TRYPTOFANU)

Metody analizy, które należy stosować do oznaczania aminokwasów (z wyjątkiem tryptofanu):

-	EN ISO 13903 Pasze - Oznaczanie zawartości aminokwasów;

-	EN ISO 17180 Pasze - Oznaczanie lizyny, metioniny i treoniny w komercyjnych produktach aminokwasowych i premiksach (4);

-	metoda analizy opisana w pkt 1-10 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wolnych (syntetycznych i naturalnych) oraz całkowitych (związanych i wolnych peptydów) aminokwasów w materiałach paszowych, mieszankach paszowych i premiksach zawierających mniej niż 10 % (5) każdego aminokwasu z użyciem analizatora aminokwasów. Metoda ma zastosowanie do następujących aminokwasów: cystyny (cysteiny), metioniny, lizyny, treoniny, alaniny, argininy, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, tyrozyny i waliny.

Metoda nie pozwala rozróżnić soli aminokwasów, a także form D i L aminokwasów. Nie można jej stosować do oznaczania tryptofanu lub hydroksyanalogów aminokwasów.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1. Wolne aminokwasy

Wolne aminokwasy są ekstrahowane rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Wyekstrahowane jednocześnie makrocząsteczki związków azotowych są wytrącane kwasem sulfosalicylowym i usuwane przez filtrowanie. Filtrowany roztwór dostosowuje się do pH 2,20. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane z zastosowaniem reakcji z ninhydryną, poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm.

2.2. Aminokwasy całkowite

Wybór sposobu postępowania zależy od oznaczanych aminokwasów. Cystynę (cysteinę) i metioninę należy przed hydrolizą poddać utlenianiu, odpowiednio do kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny. Tyrozyna musi być oznaczana w hydrolizatach próbek niepoddanych utlenieniu. Pozostałe aminokwasy wymienione w pkt 1 (Celi zakres stosowania metody) mogą być oznaczane w próbce utlenionej albo niepoddanej utlenianiu.

Utlenianie jest przeprowadzane w temperaturze 0 °C z użyciem mieszaniny kwasu nadmrówkowego i fenolu. Nadmiar odczynnika utleniającego jest rozkładany z użyciem pirosiarczynu sodu. Utleniona albo niepoddana utlenianiu próbka jest hydrolizowana kwasem chlorowodorowym (pkt 3.20) przez 23 godziny. Hydrolizat dostosowuje się do pH 2,20. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane na drodze reakcji z ninhydryną, przez fotometryczną detekcję przy 570 nm (440 nm w przypadku proliny).

3. Odczynniki

Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub równoważnej jakości (przewodność < 10 μS).

3.1.

Nadtlenek wodoru, w (w/w) = 30 %

3.2.

Kwas mrówkowy, w (w/w) = 98-100 %

3.3.

Fenol

3.4.

Pirosiarczyn sodu

3.5.

Wodorotlenek sodu

3.6.

Kwas 5-sulfosalicylowy dihydrat

3.7.

Kwas chlorowodorowy, gęstość około 1,18 g/ml

3.8.

Cytrynian trisodu, dihydrat

3.9.

2,2' tiodietanol (tiodiglikol)

3.10.

Chlorek sodu

3.11.

Ninhydryna

3.12.

Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia od 40 do 60 °C

3.13.

Norleucyna lub inny związek odpowiedni do stosowania jako wzorzec wewnętrzny.

3.14.

Azot gazowy (< 10 ppm tlenu)

3.15.

1-oktanol

3.16.

Aminokwasy

3.16.1.

Substancje wzorcowe aminokwasów wymienione w pkt 1 (Cel i zakres stosowania metody). Czyste związki, niezawierające wody krystalizacyjnej. Suszyć w warunkach próżni w obecności P2O5 lub H2SO4 przez tydzień przed użyciem.

3.16.2.

Kwas cysteinowy

3.16.3.

Sulfon metioniny

3.17.

Roztwór wodorotlenku sodu, c = 7,5 mol/l: Rozpuścić 300 g NaOH (pkt 3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.18.

Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l: Rozpuścić 40 g NaOH (pkt 3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.19.

Roztwór kwasu mrówkowego i fenolu: Zmieszać 889 g kwasu mrówkowego (pkt 3.2) z 111 g wody i dodać 4,73 g fenolu (pkt 3.3).

3.20.

Mieszanina hydrolizująca, c = 6 mol HCl/l, zawierająca 1 g fenolu/l: Dodać 1 g fenolu (pkt 3.3) do 492 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.21.

Mieszanina ekstrakcyjna, c = 0,1 mol HCl/l, zawierająca 2 % tiodiglikolu: Pobrać 8,2 ml HCl (pkt 3.7), rozpuścić w około 900 ml wody, dodać 20 ml tiodiglikolu (pkt 3.9) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą (nie mieszać bezpośrednio odczynników określonych w pkt 3.7 i 3.9).

3.22.

Kwas 5-sulfosalicylowy, ß = 6 %: Rozpuścić 60 g kwasu 5-sulfosalicylowego (pkt 3.6) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.23.

Mieszanina utleniająca (kwas nadmrówkowy - fenol): Zmieszać w małej zlewce 0,5 ml nadtlenku wodoru (pkt 3.1) z 4,5 ml roztworu kwasu mrówkowego i fenolu (pkt 3.19). Inkubować w temperaturze od 20 do 30 °C przez godzinę w celu utworzenia kwasu nadmrówkowego, następnie schłodzić w łaźni lodowej (15 minut) przed dodaniem tej mieszaniny do próbki. Uwaga: Unikać kontaktu ze skórą i nosić odzież ochronną.

3.24.

Bufor cytrynianowy, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Rozpuścić 19,61 g cytrynianu sodu (pkt 3.8), 5 ml tiodiglikolu (pkt 3.9), 1 g fenolu (pkt 3.3) i 16,50 ml HCl (pkt 3.7) w około 800 ml wody. Dostosować pH do 2,20. Uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.25.

Bufory elucyjne, przygotowane zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (pkt 4.9)

3.26.

Odczynnik ninhydrynowy, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (pkt 4.9)

3.27.

Wzorcowe roztwory aminokwasów. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C.

3.27.1.

Podstawowy roztwór wzorcowy aminokwasów (3.16.1) Każdy o stężeniu c = 2,5 μmol/ml, w kwasie chlorowodorowym. Mogą być otrzymane w handlu.

3.27.2.

Podstawowy roztwór wzorcowy kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny, c = 1,25 μmol/ml Rozpuścić 0,2115 g kwasu cysteinowego (pkt 3.16.2) i 0,2265 g sulfonu metioniny (pkt 3.16.3) w buforze cytrynianowym (pkt 3.24) w kolbie miarowej o pojemności 1 l i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez 12 miesięcy. Roztworu nie stosuje się, jeżeli podstawowy roztwór wzorcowy (pkt 3.27.1) zawiera kwas cysteinowy i sulfon metioniny.

3.27.3.

Podstawowy roztwór wzorcowy wzorca wewnętrznego, np. norleucyny, c = 20 μmol/ml Rozpuścić 0,6560 g norleucyny (pkt 3.13) w buforze cytrynianowym (pkt 3.24) w kolbie miarowej i uzupełnić kolbę do objętości 250 ml buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez sześć miesięcy.

3.27.4.

Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do użycia z hydrolizatami, c = 5 nmol/50 μl kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny i c = 10 nmol/50 μl pozostałych aminokwasów. Rozpuścić 2,2 g chlorku sodu (pkt 3.10) w zlewce o pojemności 100 ml z 30 ml buforu cytrynianowego (pkt 3.24). Dodać 4,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego aminokwasów (pkt 3.27.1), 4,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny (pkt 3.27.2) i, jeżeli jest stosowany, 0,50 ml podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3). Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.18). Przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (pkt 3.24) i zmieszać. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez trzy miesiące. Zob. również objaśnienia pkt 9.1.

3.27.5.

Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do stosowania z hydrolizatami przygotowanymi w sposób określony w pkt 5.3.3.1 i do użycia z ekstraktami (pkt 5.2). Roztwór kalibracyjny przygotowuje się w sposób określony w pkt 3.27.4, z pominięciem chlorku sodu. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 °C nie dłużej niż przez trzy miesiące.

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Kolba okrągłodenna o pojemności 100 lub 250 ml z chłodnicą zwrotną

4.2.

Butelka ze szkła borokrzemowego o pojemności 100 ml z nakrętką pokrytą gumą/teflonem (np. Duran, Schott) do stosowania w suszarce

4.3.

Suszarka z wentylacją wymuszoną i możliwością regulacji temperatury z dokładnością większą niż ± 2 oC

4.4.

Pehametr (dokładność do trzech miejsc po przecinku)

4.5.

Filtr membranowy (0,22 μm)

4.6.

Wirówka

4.7.

Rotacyjna wyparka próżniowa

4.8.

Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

4.9.

Analizator aminokwasów lub wyposażenie do HPLC z kolumną jonowymienną, przystawką do ninhydryny, postkolumnową derywatyzacją i detektorem fotometrycznym. Kolumna jest wypełniona sulfonowaną żywicą polistyrenową mającą zdolność rozdziału aminokwasów od siebie i od innych składników reagujących z ninhydryną. Przepływ buforu i ninhydryny jest przeprowadzany przez pompy o stabilności przepływu ± 0,5 % zarówno w czasie testowania kalibracyjnych roztworów, jak i analizy próbek. W niektórych analizatorach aminokwasów mogą być stosowane metody hydrolizy, w których hydrolizat zawiera stężenie sodu c = 0,8 mol/l i całą pozostałość kwasu mrówkowego z etapu utleniania. Inne analizatory nie dają zadowalającego rozdziału niektórych aminokwasów, jeżeli hydrolizat zawiera nadmiar kwasu mrówkowego lub wysokie stężenie jonów sodowych. W tym przypadku objętość kwasu jest zmniejszana przez odparowanie do objętości około 5 ml, które wykonuje się po hydrolizie i przed dostosowaniem pH. Odparowywanie należy prowadzić w warunkach próżni w temperaturze nie wyższej niż 40 °C.

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie próbki

Zmielić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgoci przed zmieleniem wysuszyć albo na powietrzu w temperaturze nieprzekraczającej 50 °C, albo przez liofilizację. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed zmieleniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.12).

5.2. Oznaczanie wolnych aminokwasów

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, odpowiednią ilość (1-5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby stożkowej i dodać 100,0 ml mieszaniny ekstrakcyjnej (pkt 3.21). Wytrząsać mieszaninę przez 60 minut, używając mechanicznej wytrząsarki lub mieszadła magnetycznego (pkt 4.8). Odstawić do sedymentacji osadu i pobrać pipetą 10,0 ml supernatantu do zlewki o objętości 100 ml.

Dodać, mieszając, 5,0 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego (pkt 3.22) i kontynuować mieszanie z użyciem mieszadła magnetycznego przez 5 minut. Przefiltrować lub odwirować supernatant w celu usunięcia osadu. Umieścić 10,0 ml otrzymanego roztworu w zlewce o objętości 100 ml, dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.18), przenieść do kolby o miarowej odpowiedniej pojemności, z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) i uzupełnić roztworem buforowym do pełnej objętości tej kolby (pkt 3.24).

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, dodać 1,00 ml wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3) na każde 100 ml końcowego roztworu i uzupełnić roztworem buforowym (pkt 3.24) do pełnej objętości kolby.

Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w 5.4.

Jeżeli ekstrakty nie będą oznaczane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 °C.

5.3. Oznaczanie całkowitej zawartości aminokwasów

5.3.1. Utlenianie

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do:

-	kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml (pkt 4.1) do hydrolizy otwartej (pkt 5.3.2.3) lub

-	kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (pkt 4.1), jeżeli wymagane jest niskie stężenie sodu (pkt 5.3.3.1), lub

-	butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (pkt 4.2) (w przypadku hydrolizy zamkniętej pkt 5.3.2.4).

Odważona część próbki musi zawierać około 10 mg azotu, a poziom wilgotności nie może przekraczać 100 mg.

Umieścić kolbę lub butelkę w lodowej łaźni wodnej i schłodzić do temperatury 0 °C, dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (pkt 3.23) i zamieszać, używając szklanej szpatułki z wygiętym końcem. Uszczelnić kolbę/butelkę wraz ze szpatułką, stosując hermetyczną powłokę, umieścić wraz z lodową łaźnią wodną w lodówce o temperaturze 0 °C i pozostawić na 16 godzin. Po 16 godzinach wyjąć z lodówki i rozłożyć nadmiar odczynnika utleniającego przez dodanie 0,84 g pirosiarczynu sodu (pkt 3.4).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.1.

5.3.2. Hydroliza

5.3.2.1.

Hydroliza próbek utlenionych Do utlenionej próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.3.1 dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (pkt 3.20), zwracając uwagę, aby zmyć pozostałości próbki przywierające do bocznych ścianek naczynia i szpatułki. W zależności od sposobu przeprowadzonej hydrolizy postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Hydroliza próbek nieutlenionych Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby okrągłodennej o pojemności 100 lub 250 ml (pkt 4.1) lub do butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (pkt 4.2). Odważona część próbki musi zawierać około 10 mg azotu. Ostrożnie dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (pkt 3.20) i zmieszać z próbką. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Hydroliza otwarta Do kolby z mieszaniną, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, dodać 3 szklane koraliki i gotować, utrzymując stan wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 23 godziny. Po zakończonej hydrolizie przemyć chłodnicę 5 ml buforu cytrynianowego (pkt 3.24). Odłączyć kolbę i schłodzić w łaźni lodowej. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.2.4.

Hydroliza zamknięta Umieścić butelkę zawierającą mieszaninę, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, w suszarce (pkt 4.3) w temperaturze 110 °C. W czasie pierwszej godziny hydrolizy, aby uniknąć gwałtownego wzrostu ciśnienia (w wyniku powstawania substancji gazowych) i wybuchu, umieścić nakrętkę na naczyniu. Nie zamykać naczynia nakrętką. Po godzinie dokręcić nakrętkę i pozostawić w suszarce (pkt 4.3) przez 23 godziny. Po zakończeniu hydrolizy wyjąć butelkę z suszarki, ostrożnie odkręcić nakrętkę i umieścić butelkę w lodowej łaźni wodnej. Pozostawić do schłodzenia. W zależności od sposobu dostosowania pH (pkt 5.3.3) przenieść ilościowo zawartość butelki do zlewki lub kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml, stosując bufor cytrynianowy (pkt 3.24). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.3. Dostosowanie pH

W zależności od tolerancji analizatora aminokwasów (pkt 4.9) na sód pH dostosowuje się w sposób określony w pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2.

5.3.3.1.

Dla systemów chromatograficznych (pkt 4.9) wymagających niskiego stężenia sodu Wskazane jest zastosowanie podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3), gdy wykorzystywane są analizatory aminokwasów wymagające niskiego stężenia sodu (w przypadku gdy należy zredukować objętość kwasu). W tym przypadku dodać 2,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3) do hydrolizatu przed odparowaniem. Dodać 2 krople 1-oktanolu (pkt 3.15) do hydrolizatu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4. Stosując wyparkę rotacyjną (pkt 4.7), zmniejszyć w warunkach próżni i w temperaturze 40 °C objętość do 5-10 ml. Jeżeli objętość zostanie przypadkowo zredukowana poniżej 5 ml, hydrolizat należy wyrzucić i powtórzyć analizę. Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.18) i postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.3.2.

Dla pozostałych analizatorów aminokwasów (pkt 4.9) Pobrać hydrolizaty otrzymane w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4 i częściowo je zneutralizować poprzez ostrożne dodanie 17 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.17) i jednoczesne mieszanie, przy czym należy zwrócić uwagę, aby temperatura roztworu była niższa niż 40 °C. Dostosować pH do 2,20 w temperaturze pokojowej, dodając roztwór wodorotlenku sodu (pkt 3.17), a pod koniec roztwór wodorotlenku sodu (pkt 3.18). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.4. Roztwór próbki do analizy chromatograficznej

Przenieść ilościowo hydrolizat o dostosowanym pH (pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2) z użyciem buforu cytrynianowego (pkt 3.24) do kolby miarowej o pojemności 200 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem (pkt 3.24).

Jeżeli wcześniej nie dodawano wzorca wewnętrznego, dodać 2,00 ml wzorca wewnętrznego (pkt 3.27.3) i uzupełnić buforem cytrynianowym (pkt 3.24) do pełnej objętości kolby. Dokładnie wymieszać.

Przejść do analizy chromatograficznej (pkt 5.4).

Jeżeli roztwory próbek nie będą analizowane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 °C.

5.4. Chromatografia

Przed analizą chromatograficzną doprowadzić ekstrakt (pkt 5.2) lub hydrolizat (pkt 5.3.4) do temperatury pokojowej. Wstrząsnąć mieszaniną i przefiltrować jej odpowiednią ilość przez filtr membranowy 0,22 μm (pkt 4.5). Otrzymany klarowny roztwór jest poddawany chromatografii jonowymiennej przy wykorzystaniu analizatora aminokwasów (pkt 4.9).

Dozowanie wykonuje się ręcznie lub automatycznie. Ważne jest, aby na kolumnę nanieść takie same ilości roztworów z dokładnością ± 0,5 % zarówno w przypadku analizy wzorców, jak i badanych próbek, z wyjątkiem gdy jest stosowany wzorzec wewnętrzny, oraz aby stosunek sodu do aminokwasu w roztworze badanej próbki był jak najbardziej zbliżony do tego w roztworze wzorcowym.

Zasadniczo częstość przeprowadzania kalibracji zależy od stabilności odczynnika ninhydrynowego i od systemu analitycznego. Wzorzec lub próbka są rozcieńczane buforem cytrynianowym (pkt 3.24), tak aby powierzchnia piku wzorca odpowiadała od 30 do 200 % powierzchni piku badanej próbki aminokwasu.

Analiza chromatograficzna aminokwasów będzie różnić się nieznacznie w zależności od typu stosowanego analizatora i żywicy. Wybrany system musi mieć zdolność oddzielenia od siebie aminokwasów oraz od składników reagujących z ninhydryną. W badanym zakresie stosowany system chromatograficzny musi dawać liniową odpowiedź na zmiany ilości aminokwasów dodawanych na kolumnę.

W czasie analizy chromatograficznej opisany poniżej stosunek pik - dolina odnosi się do przypadku, gdy jest analizowany roztwór równomolowy oznaczanego aminokwasu. Roztwór równomolowy aminokwasu musi zawierać co najmniej 30 % maksymalnej zawartości każdego aminokwasu, co można dokładnie zmierzyć z użyciem analizatora aminokwasów (pkt 4.9).

Dla oddzielenia treoniny od seryny stosunek pik - dolina niższego z pokrywających się aminokwasów na chromatografie nie może przekraczać 2:10 (w przypadku gdy oznaczane są tylko cystyna (cysteina), metionina, treonina i lizyna, niewystarczające oddzielenie od sąsiednich pików będzie ujemnie wpływało na oznaczenie). Dla wszystkich innych aminokwasów rozdział musi być lepszy niż 1:10.

System musi zapewniać oddzielenie lizyny od »artefaktów lizyny« i od ornityny.

6. Obliczanie wyników

Powierzchnię pików próbki i wzorca mierzy się dla każdego pojedynczego aminokwasu i obliczana jest zawartość aminokwasu (X) w g/kg próbki.

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, wyrażenie należy pomnożyć przez:

A	=	powierzchnia piku hydrolizatu lub ekstraktu
B	=	powierzchnia piku kalibracyjnego roztworu wzorcowego
C	=	powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w hydrolizacie lub ekstrakcie
D	=	powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, kalibracyjny roztwór wzorcowy
M	=	masa molowa oznaczanego aminokwasu
c	=	stężenie wzorca w μmol/ml
m	=	masa próbki w g (przeliczona na masę oryginalnej próbki w przypadku podsuszania lub odtłuszczania)
V	=	hydrolizat ogółem w ml (pkt 5.3.4) lub obliczona całkowita objętość w ml rozcieńczonego ekstraktu (pkt 6.1)

Cystyna i cysteina są oznaczane jako kwas cysteinowy w hydrolizatach utlenionej próbki, ale są obliczane jak cystyna (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), przy zastosowaniu M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina jest oznaczana jako sulfon metioniny w hydrolizatach utlenionej próbki, ale jest obliczana jak metionina, z zastosowaniem M metioniny: 149,21 g/mol.

Dodana wolna metionina jest oznaczana po ekstrakcji jako metionina, przy czym dla obliczeń stosowana jest taka sama wartość M.

6.1.

Całkowitą objętość rozcieńczonych ekstraktów (F) w przypadku oznaczania zawartości wolnych aminokwasów (pkt 5.2) oblicza się według następującego wzoru: V = objętość końcowego ekstraktu

7. Ocena metody

W 1990 r. przeprowadzono międzynarodowe badanie porównawcze metody z użyciem czterech pasz (mieszanki paszowej dla świń, mieszanki paszowej dla brojlerów, koncentratu białkowego i premiksu).

Uwaga:

Metoda została przebadana podczas drugiego międzynarodowego badania porównawczego w 2003 r., z wykorzystaniem ślepych, pobranych dwukrotnie próbek paszy dla brojlerów do tuczu końcowego, paszy startowej dla brojlerów, kukurydzy, mączki rybnej i mączki drobiowej. Szczegółowe informacje można znaleźć w normie EN ISO 13903.

W tabelach w niniejszym punkcie podano wyniki badania porównawczego z 1990 r. po odrzuceniu wartości odstających oraz odchyleń przeciętnych i standardowych:

Średnie wielkości w g/kg

Materiał referencyjny	Aminokwas
	Treonina	Cystyna/cysteina	Metionina	Lizyna
Mieszanka paszowa dla świń	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Mieszanka paszowa dla brojlerów	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Koncentrat białkowy	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premiks	58,42 n = 16	-	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = liczba uczestniczących laboratoriów

7.1. Powtarzalność

Powtarzalność wyrażona jako »odchylenie standardowe w ramach laboratorium« badania porównawczego przedstawionego w tabeli powyżej jest przedstawiona w poniższych tabelach:

Współczynnik zmienności (%) dla powtarzalności (CVr)

Materiał referencyjny	Aminokwas
	Treonina	Cystyna/cysteina	Metionina	Lizyna
Mieszanka paszowa dla świń	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Mieszanka paszowa dla brojlerów	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Koncentrat białkowy	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premiks	2,2 n = 16	-	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = liczba uczestniczących laboratoriów

7.2. Odtwarzalność

Wyniki odchylenia standardowego między laboratoriami otrzymane w wyniku przeprowadzenia omawianego powyżej porównawczego badania są przedstawione w poniższej tabeli:

Współczynnik zmienności (%) dla odtwarzalności (CVR)

Materiał referencyjny	Aminokwas
	Treonina	Cystyna/cysteina	Metionina	Lizyna
Mieszanka paszowa dla świń	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Mieszanka paszowa dla brojlerów	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Koncentrat białkowy	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premiks	4,3 n = 16	-	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = liczba uczestniczących laboratoriów

8. Stosowanie materiałów odniesienia

Prawidłowe stosowanie metody weryfikuje się przez wykonywanie powtórnych pomiarów certyfikowanych materiałów odniesienia, jeżeli takie są dostępne. Zalecana jest także kalibracja z zastosowaniem certyfikowanych kalibracyjnych roztworów aminokwasów.

9. Objaśnienia

9.1.

Z powodu różnic pomiędzy analizatorami aminokwasów końcowe stężenia kalibracyjnych roztworów aminokwasów wzorcowych (zob. pkt 3.27.4 i 3.27.5) oraz hydrolizatu (zob. pkt 5.3.4) należy traktować jako przykładowe. Zakres liniowej odpowiedzi aparatu należy sprawdzić dla wszystkich aminokwasów. Roztwór wzorcowy jest rozcieńczany buforem cytrynianowym, tak aby otrzymać powierzchnię piku o średnim zasięgu.

9.2.

Jeżeli do analizy hydrolizatów jest wykorzystywany wysoko sprawny chromatograf cieczowy, należy zoptymalizować warunki doświadczalne analizy zgodnie z zaleceniami producenta.

9.3.

Przy stosowaniu tej metody do mieszanek paszowych lub premiksów zawierających więcej niż 1 % chlorków (koncentraty, mieszanki paszowe mineralne, mieszanki paszowe uzupełniające) wyniki oznaczania metioniny mogą być zaniżone i należy stosować specjalne postępowanie.

10. Kryteria wydajności

Zestawienie wyników (z wyjątkiem tyrozyny) pochodzących z dwóch porównań międzylaboratoryjnych (z 1990 r. przedstawionych w pkt 7 powyżej i z 2005 r. opisanych w normie EN/ISO 13903) daje następujące kryteria powtarzalności i odtwarzalności. Wartości uzyskane w tych dwóch badaniach międzylaboratoryjnych mogą nie mieć zastosowania do zakresów stężeń i matryc innych niż podane.

10.1. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych dla tej samej próbki w tym samym laboratorium i przez tego samego analityka nie może przekraczać:

-	6 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku glicyny, alaniny, lizyny, proliny, kwasu glutaminowego, izoleucyny i histydyny;

-	8 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku treoniny, fenyloalaniny, metioniny, kwasu asparaginowego i leucyny;

-	10 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku argininy i waliny;

-	12 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu seryna;

-	15 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu cystyna (cysteina).

10.2. Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach lub przez różnych analityków nie może przekraczać:

-	15 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku glicyny, alaniny i treoniny;

-	20 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku lizyny, proliny, fenyloalaniny, metioniny i kwasu asparaginowego;

-	22 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku kwasu glutaminowego i leucyny;

-	27 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu arginina;

-	32 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu izoleucyna;

-	35 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasów w przypadku waliny i seryny;

-	40 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu histydyna;

-	50 % względem wyższej wartości, dla całkowitej zawartości aminokwasu cystyna (cysteina).

F. OZNACZANIE TRYPTOFANU

Metody analizy, które należy stosować do oznaczania tryptofanu:

-	EN ISO 13904 Pasze - Oznaczanie zawartości tryptofanu;

-	metoda analizy opisana w pkt 1-9 poniżej.

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości całkowitego i wolnego tryptofanu w paszach. Metoda nie wyróżnia form D i L.

2. Sposób przeprowadzenia metody

W celu oznaczenia całkowitego tryptofanu próbka jest hydrolizowana w środowisku zasadowym z użyciem nasyconego roztworu wodorotlenku baru i ogrzewana do 110 °C przez 20 godzin. Po hydrolizie dodawany jest wzorzec wewnętrzny.

W celu oznaczenia wolnego tryptofanu próbka jest ekstrahowana w warunkach lekko kwaśnych w obecności wzorca wewnętrznego.

Tryptofan i wzorzec wewnętrzny w hydrolizacie lub w ekstrakcie jest oznaczany metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

3. Odczynniki

3.1.

Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub o równoważnej jakości (przewodność < 10 μS/cm).

3.2.

Substancja wzorcowa: tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu

3.3.

Substancja wzorcowa wewnętrzna: α-metylo-tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu

3.4.

Wodorotlenek baru, oktahydrat (należy uważać, aby nie wystawiać Ba(OH)2.8 H2O na nadmierne działanie powietrza, aby uniknąć tworzenia się BaCO3, który mógłby utrudniać oznaczenie) (zob. objaśnienia pkt 9.3)

3.5.

Wodorotlenek sodu

3.6.

Kwas ortofosforowy, w (w/w) = 85 %

3.7.

Kwas chlorowodorowy, ρ20 1,19 g/ml

3.8.

Metanol do HPLC

3.9.

Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia od 40 do 60 °C

3.10.

Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l Rozpuścić 40,0 g NaOH (pkt 3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 l wodą (pkt 3.1).

3.11.

Kwas chlorowodorowy, c = 6 mol/l: Odmierzyć 492 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.12.

Kwas chlorowodorowy, c = 1 mol/l: Odmierzyć 82 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.13.

Kwas chlorowodorowy, c = 0,1 mol/l: Odmierzyć 8,2 ml HCl (pkt 3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.14.

Kwas ortofosforowy, c = 0,5 mol/l: Odmierzyć 34 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą (pkt 3.1).

3.15.

Stężony roztwór tryptofanu (pkt 3.2), c = 2,50 μmol/ml: W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2553 g tryptofanu (pkt 3.2) w kwasie chlorowodorowym (pkt 3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (pkt 3.13). Przechowywać w temperaturze -18 °C nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

3.16.

Stężony roztwór wzorca wewnętrznego, c = 2,50 μmol/ml: W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2728 g α-metylo-tryptofanu (pkt 3.3) w kwasie chlorowodorowym (pkt 3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (pkt 3.13). Przechowywać w temperaturze -18 °C nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

3.17.

Kalibracyjny roztwór wzorcowy tryptofanu i wzorca wewnętrznego: Odmierzyć 2,00 ml stężonego roztworu tryptofanu (pkt 3.15) i 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (pkt 3.16). Rozcieńczyć wodą (pkt 3.1) i metanolem (pkt 3.8) w przybliżeniu do tej samej objętości i tego samego stężenia metanolu (10-30 %) jak w końcowym hydrolizacie. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem. Chronić przed bezpośrednim działaniem światła podczas przygotowywania.

3.18.

Kwas octowy

3.19.

1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanol

3.20.

Etanoloamina w (w/w) > 98 %

3.21.

Roztwór 1 g 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (pkt 3.19) w 100 ml metanolu (pkt 3.8)

3.22.

Faza ruchoma do HPLC: 3,00 g kwasu octowego (pkt 3.18) + 900 ml wody (pkt 3.1) + 50,0 ml roztworu (pkt 3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (pkt 3.19) w metanolu (pkt 3.8) (1 g/100 ml). Dostosować pH do 5,00 z użyciem etanoloaminy (pkt 3.20). Uzupełnić do objętości 1 000 ml wodą (pkt 3.1).

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Wyposażenie HPLC z detektorem spektrofluorometrycznym

4.2.

Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważna

4.3.

Pehametr

4.4.

Kolba z polipropylenu o pojemności 125 ml, z szeroką szyjką i nakrętką

4.5.

Filtr membranowy, 0,45 μm

4.6.

Autoklaw, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Wytrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

4.8.

Wstrząsarka

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie próbek

Zmielić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgoci przed zmieleniem wysuszyć albo na powietrzu w temperaturze nieprzekraczającej 50 °C, albo przez liofilizację. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed zmieleniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (pkt 3.9).

5.2. Oznaczanie wolnego tryptofanu (ekstrakt)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, odpowiednią ilość (1-5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w 5.1 do kolby stożkowej. Dodać 100,0 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.13) i 5,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.16). Wstrząsać lub mieszać przez 60 minut z użyciem wytrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (pkt 4.7). Pozostawić do oddzielenia się osadu i przenieść pipetą 10,0 ml supernatantu do zlewki. Dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.14). Dostosować pH do 3 z użyciem wodorotlenku sodu (pkt 3.10). Dodać odpowiednią ilość metanolu (pkt 3.8), aby uzyskać stężenie od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości właściwej dla chromatografii (objętość zbliżona do objętości kalibracyjnego roztworu wzorcowego (pkt 3.17)).

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4.

Roztwór wzorcowy i ekstrakty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty można przechowywać w temperaturze 5 °C nie dłużej niż przez 3 dni.

5.3. Oznaczanie całkowitego tryptofanu (hydrolizat)

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby z polipropylenu (pkt 4.4). Odważona część próbki musi zawierać około 10 mg azotu. Dodać 8,4 g oktahydratu wodorotlenku baru (pkt 3.4) i 10 ml wody. Wymieszać przy użyciu wstrząsarki (pkt 4.8) lub mieszadła magnetycznego (pkt 4.7). Pozostawić osłonięty teflonem magnes w mieszaninie. Spłukać ściany naczynia z użyciem 4 ml wody. Nałożyć nakrętkę i zamknąć luźno kolbę. Przenieść kolbę do autoklawu (pkt 4.6) z wrzącą wodą i parować przez 30 do 60 minut. Zamknąć autoklaw i autoklawować w temperaturze 110 (± 2) °C przez 20 godzin.

Przed otwarciem autoklawu obniżyć temperaturę nieco poniżej 100 °C. W celu uniknięcia krystalizacji Ba(OH)2.8 H2O dodać do ciepłej mieszaniny 30 ml wody o temperaturze pokojowej. Łagodnie wstrząsać lub mieszać. Dodać 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (pkt 3.16). Studzić naczynia w łaźni wodnej lub lodowej przez 15 minut.

Następnie dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (pkt 3.14). Utrzymując naczynie w zimnej łaźni, zobojętnić z użyciem HCl (pkt 3.11), mieszając, i dostosować pH do 3,0 z HCl (pkt 3.12). Dodać ilość metanolu konieczną do uzyskania stężenia od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości koniecznej dla chromatografii (np. 100 ml). Dodanie metanolu nie może powodować wytrącania.

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (pkt 4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4.

Roztwór wzorcowy i hydrolizaty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy hydrolizatów tego samego dnia, można je przechowywać w temperaturze 5 °C nie dłużej niż przez 3 dni.

5.4. Oznaczanie HPLC

Poniższe parametry elucji izokratycznej podano jako przykładowe; inne parametry mogą być stosowane, pod warunkiem że ich zastosowanie doprowadzi do otrzymania równoważnych wyników (zob. również objaśnienia pkt 9.1 i 9.2):

Kolumna do chromatografii cieczowej (pkt 4.2):	125 mm x 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważna kolumna
Temperatura kolumny:	temperatura pokojowa
Faza ruchoma (pkt 3.22):	3,00 g kwasu octowego (pkt 3.18) + 900 ml wody (pkt 3.1) +50,0 ml roztworu (pkt 3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (pkt 3.19) w metanolu (pkt 3.8) (1 g/100 ml). Dostosować pH do 5,00 z użyciem etanoloaminy (pkt 3.20). Uzupełnić do objętości 1 000 ml wodą (pkt 3.1)
Prędkość przepływu:	1 ml/min
Całkowity czas analizy:	około 34 min
Długość fali przy detekcji:	wzbudzenie: 280 nm, emisja: 356 nm
Dozowana objętość:	20 μl

6. Obliczanie wyników

Oblicza się zawartość tryptofanu (X) w g na 100 g próbki.

A	=	powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, kalibracyjny roztwór wzorcowy (pkt 3.17)
B	=	powierzchnia piku tryptofanu, ekstraktu (pkt 5.2) lub hydrolizatu (pkt 5.3)
V1	=	objętość w ml (2 ml) stężonego roztworu tryptofanu (pkt 3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (pkt 3.17)
c	=	stężenie w μmol/ml (= 2,50) stężonego roztworu tryptofanu (pkt 3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (pkt 3.17)
V2	=	objętość w ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.16) dodanego przy ekstrakcji (pkt 5.2) (= 5,00 ml) lub do hydrolizatu (pkt 5.3) (= 2,00 ml)
C	=	powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, ekstrakt (pkt 5.2) lub hydrolizat (pkt 5.3)
D	=	powierzchnia piku tryptofanu, kalibracyjny roztwór wzorcowy (pkt 3.17)
V3	=	objętość w ml (= 2,00 ml) stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (pkt 3.16) dodanego do kalibracyjnego roztworu wzorcowego (pkt 3.17)
m	=	masa próbki w g (skorygowana względem masy wyjściowej, jeżeli była suszona lub odtłuszczana)
M	=	masa molowa tryptofanu (= 204,23 g/mol)

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % względem najwyższego wyniku.

8. Wyniki porównania międzylaboratoryjnego

W UE przeprowadzono porównanie międzylaboratoryjne (czwarte badanie porównawcze), w którym trzy próbki były analizowane przez maksymalnie 12 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy. W odniesieniu do każdej próbki przeprowadzono powtórne analizy (pięciokrotnie). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

	Próbka 1 Pasza dla świń	Próbka 2 Pasza dla świń uzupełniona L-tryptofanem	Próbka 3 Koncentrat paszowy dla świń
L	12	12	12
n Średnia [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = liczba laboratoriów, które przedłożyły wyniki n = liczba pojedynczych wyników zachowanych po eliminacji wartości odstających (według Cochrana, test na wartość odstającą Dixona) sr = odchylenie standardowe powtarzalności SR = odchylenie standardowe odtwarzalności r = powtarzalność R = odtwarzalność CVr = współczynnik zmienności powtarzalności w % CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności w %

W innym porównaniu międzylaboratoryjnym przeprowadzonym w UE (trzecie badanie porównawcze) dwie próbki były analizowane przez maksymalnie 13 laboratoriów w celu sprawdzenia metody ekstrakcji wolnego tryptofanu. W odniesieniu do każdej próbki przeprowadzono powtórne analizy (pięciokrotnie). W poniższej tabeli podano wyniki przeprowadzonych badań.

	Próbka 4 Mieszanka pszenicy i soi	Próbka 5 Mieszanka pszenicy i soi (= próbka 4) z dodatkiem tryptofanu (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Średnia [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = liczba laboratoriów, które przedłożyły wyniki n = liczba pojedynczych wyników zachowanych po eliminacji wartości odstających (według Cochrana, test na wartość odstającą Dixona) sr = odchylenie standardowe powtarzalności SR = odchylenie standardowe odtwarzalności r = powtarzalność R = odtwarzalność CVr = współczynnik zmienności powtarzalności w % CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności w %

W kolejnym badaniu porównawczym przeprowadzonym w UE cztery próbki były analizowane przez maksymalnie 7 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy tryptofanu. Wyniki są podane poniżej. W odniesieniu do każdej próbki przeprowadzono powtórne analizy (pięciokrotnie).

	Próbka 1 Mieszanka paszowa dla świń (CRM 117)	Próbka 2 Niskotłuszczowa mączka rybna (CRM 118)	Próbka 3 Mączka sojowa (CRM 119)	Próbka 4 Odtłuszczone mleko w proszku (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Średnia [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = liczba laboratoriów, które przedłożyły wyniki n = liczba pojedynczych wyników zachowanych po eliminacji wartości odstających (według Cochrana, test na wartość odstającą Dixona) sr = odchylenie standardowe powtarzalności SR = odchylenie standardowe odtwarzalności r = powtarzalność R = odtwarzalność CVr = współczynnik zmienności powtarzalności w % CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności w %

9. Objaśnienia

9.1.

Lepszy rozdział tryptofanu i α-metylo-tryptofanu może nastąpić przy uwzględnieniu szczególnych warunków chromatograficznych. Elucja izokratyczna po gradientowym czyszczeniu kolumny: Kolumna do chromatografii cieczowej: 125 mm x 4 mm, C18, wypełnienie 5 μm lub równoważna Temperatura kolumny: 32 °C Faza ruchoma: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V+V) B: metanol Program czyszczenia gradientowego: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Prędkość przepływu: 1,2 ml/min Całkowity czas analizy: około 33 min

9.2.

Analiza chromatograficzna będzie się zmieniać w zależności od typu HPLC i materiału użytego do wypełnienia kolumny. Wybrany system musi umożliwić uzyskanie oddzielającej linii bazowej pomiędzy tryptofanem i wzorcem wewnętrznym. Ponadto ważne jest, aby produkty degradacji zostały dobrze oddzielone od tryptofanu i wzorca wewnętrznego. Hydrolizaty bez wzorca wewnętrznego należy poddać analizie w celu sprawdzenia linii bazowej stosownie do wzorca wewnętrznego względem zanieczyszczeń. Ważne jest, aby czas analizy był wystarczająco długi dla elucji wszystkich produktów degradacji, w przeciwnym razie ostatnie eluujące piki na chromatogramie mogą zakłócać kolejną analizę. W zakresie badanych stężeń układ chromatograficzny musi zapewniać liniową odpowiedź. Liniową odpowiedź należy mierzyć przy stałym (normalnym) stężeniu wzorca wewnętrznego i zmieniających się stężeniach tryptofanu. Ważne jest, aby wielkość pików tryptofanu i wzorca wewnętrznego zawierała się w liniowym zakresie układu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Jeżeli piki tryptofanu lub wzorca wewnętrznego są zbyt małe lub zbyt duże, analizę należy powtórzyć przy zmienionej wielkości próbki lub jej objętości końcowej.

9.3. Wodorotlenek baru

Fakt, że wodorotlenek baru z czasem jest coraz trudniejszy do rozpuszczenia, wpływa na nieklarowność roztworu do oznaczania HPLC, która może być przyczyną zaniżania wyników oznaczania tryptofanu.

G. OZNACZANIE SUROWEGO OLEJU I TŁUSZCZU

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości surowych olejów i tłuszczów w paszach.

Zastosowanie dwóch sposobów postępowania opisanych poniżej zależy od rodzaju i składu paszy oraz celu prowadzenia analizy.

W celu oznaczenia surowych olejów i tłuszczów w nasionach i owocach oleistych, a także w paszy, w której zawartość olejów/tłuszczów surowych jest wyższa niż 15 %, ekstrakcję należy przeprowadzić metodą A, a ponowną ekstrakcję - metodą B (pkt 5.3).

1.1. Postępowanie A - Bezpośrednio ekstrahowane surowe oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia roślinnego, z wyjątkiem tych, które zostały objęte zakresem postępowania B.

1.2. Postępowanie B - Całkowite surowe oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego i wszystkich mieszanek paszowych. Jest stosowane do wszystkich materiałów, z których oleje i tłuszcze nie mogą być w całości wyekstrahowane bez uprzedniej hydrolizy (np. gluten, drożdże, białka ziemniaczane i produkty przetworzone np. poprzez ekstruzję, płatkowanie i ogrzewanie).

1.3. Interpretacja wyników

We wszystkich przypadkach, w których wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B jest wyższy od wyniku otrzymanego przy zastosowaniu postępowania A, wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B należy traktować jako wartość prawdziwą.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1. Postępowanie A

Próbka jest poddawana ekstrakcji eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest oddestylowany, a pozostałość jest suszona i ważona.

2.2. Postępowanie B

Próbka jest ogrzewana kwasem chlorowodorowym. Mieszanina jest oziębiana i filtrowana. Pozostałość jest przemywana i suszona, a następnie poddawana oznaczaniu przy zastosowaniu postępowania A.

3. Odczynniki

3.1.

Eter naftowy, zakres temperatur wrzenia od 40 do 60 °C. Wartość bromowa musi być niższa niż 1, a pozostałość po odparowaniu niższa niż 2 mg/100 ml.

3.2.

Siarczan sodu bezwodny

3.3.

Kwas chlorowodorowy, c = 3 mol/l

3.4.

Pomocniczy materiał filtracyjny, np. Kieselgur, Hyflo-supercel

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Aparat ekstrakcyjny. Jeżeli aparat jest wyposażony w syfon (aparat Soxhleta), prędkość skraplania musi wynosić około 10 cykli na godzinę. Jeżeli aparat nie ma syfonu, wówczas prędkość skraplania musi wynosić około 10 ml na minutę.

4.2.

Gilzy ekstrakcyjne, niezawierające substancji rozpuszczalnych w eterze naftowym, o porowatości odpowiadającej wymaganiom określonym w pkt 4.1

4.3.

Suszarka - suszarka próżniowa z możliwością ustawienia temperatury suszenia na 75 ± 3 °C lub suszarka nawiewna z możliwością ustawienia temperatury na 100 ± 3 °C

5. Sposób postępowania

5.1. Postępowanie A (zob. pkt 8.1)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, przenieść do gilzy ekstrakcyjnej (pkt 4.2) i przykryć beztłuszczowym zwitkiem waty bawełnianej.

Umieścić gilzę w aparacie ekstrakcyjnym (pkt 4.1) i ekstrahować przez sześć godzin eterem naftowym (pkt 3.1). Zebrać ekstrakt eterowy do suchej, zważonej kolby zawierającej kawałki kamienia pumeksowego (6).

Oddestylować rozpuszczalnik. Suszyć pozostałość, umieszczając kolbę w suszarce (pkt 4.3) na półtorej godziny. Schłodzić w eksykatorze i zważyć. Suszyć ponownie przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy olejów i tłuszczów (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 1 mg).

5.2. Postępowanie B

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki (zob. pkt 8.2), umieścić w zlewce o pojemności 400 ml lub w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml i dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.3) oraz kawałki kamienia pumeksowego. Przykryć zlewkę szkłem zegarkowym lub dopasować kolbę stożkową z chłodnicą zwrotną. Doprowadzić mieszaninę do spokojnego wrzenia w małym płomieniu palnika lub na płycie grzejnej i utrzymywać wrzenie przez godzinę. Nie dopuszczać do osadzania się produktu na ścianach pojemnika.

Schłodzić i dodać pomocniczy materiał filtracyjny (pkt 3.4) w ilości zapobiegającej jakimkolwiek stratom oleju i tłuszczu podczas filtracji. Przefiltrować przez zwilżoną, beztłuszczową podwójną bibułę filtracyjną. Przemywać pozostałość zimną wodą do uzyskania obojętnego filtratu. Sprawdzić, czy filtrat nie zawiera śladów olejów lub tłuszczów. Ich obecność wskazuje na konieczność przeprowadzenia przed hydrolizą ekstrakcji eterem naftowym, przy zastosowaniu postępowania A.

Umieścić na szkle zegarkowym podwójną bibułę filtracyjną z pozostałością i suszyć przez 1,5 godziny w suszarce nawiewnej (pkt 4.3) w temperaturze 100 ± 3 °C.

Umieścić podwójną bibułę filtracyjną zawierającą suchą pozostałość w gilzie ekstrakcyjnej (pkt 4.2) i przykryć zwitkiem beztłuszczowej waty bawełnianej. Umieścić gilzę w aparacie ekstrakcyjnym (pkt 4.1) i postępować w sposób określony w pkt 5.1 akapity drugi i trzeci.

5.3. Postępowanie A i ponowna ekstrakcja metodą B

W celu oznaczenia surowych olejów i tłuszczów w nasionach i owocach oleistych, a także w paszy, w której zawartość surowych olejów/tłuszczów jest wyższa niż 15 %, ekstrakcję należy przeprowadzić metodą A, a ponowną ekstrakcję - metodą B.

Oznacza to, że po ekstrakcji eterem naftowym (postępowanie A) pozostałość lub część pozostałości ponownie ekstrahuje się kwasem chlorowodorowym (procedura B). Zawartość surowych olejów i tłuszczów jest sumą wyniku postępowania A i B.

6. Wyrażanie wyników

Masę pozostałości wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka nie może przekraczać:

-	0,2 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości surowych olejów i tłuszczów niższej niż 5 %,

-	4,0 % względem najwyższego wyniku dla zawartości od 5 do 10 %,

-	0,4 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości wyższej niż 10 %.

8. Objaśnienia

8.1.

Dla produktów o wysokiej zawartości olejów i tłuszczów, które są trudne do rozdrobnienia lub w przypadku których trudno jest uzyskać jednorodną zredukowaną próbkę badaną, postępować w sposób podany poniżej. Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 20 g próbki i zmieszać z co najmniej 10 g bezwodnego siarczanu sodu (pkt 3.2). Ekstrahować eterem naftowym (pkt 3.1) w sposób określony w pkt 5.1. Otrzymany ekstrakt uzupełnić do objętości 500 ml eterem naftowym (pkt 3.1) i zmieszać. Pobrać 50 ml roztworu i przenieść do małej, suchej i zważonej kolby zawierającej kawałki kamienia pumeksowego. Oddestylować rozpuszczalnik, suszyć i postępować, jak wskazano w pkt 5.1 akapit ostatni. Usunąć rozpuszczalnik z pozostałości po ekstrakcji w gilzie, rozdrobnić pozostałość na 1 mm cząstki, ponownie umieścić w gilzie (nie dodawać siarczanu sodu) i postępować, jak wskazano w pkt 5.1 akapity drugi i trzeci. Zawartość olejów i tłuszczów obliczyć jako udział procentowy w próbce, według następującego wzoru: gdzie: m1 = masa w gramach pozostałości po pierwszej ekstrakcji (podwielokrotność ekstraktu) m2 = masa w gramach pozostałości po drugiej ekstrakcji

8.2.

Dla niektórych produktów (np. o niskiej zawartości olejów i tłuszczów) badaną próbkę można zwiększyć.

8.3.

W przypadku karmy dla zwierząt domowych o wysokiej zawartości wody może wystąpić potrzeba zmieszania jej przed hydrolizą i ekstrakcją z bezwodnym siarczanem sodu, z zastosowaniem postępowania B.

8.4.

W przypadku postępowania określonego w pkt 5.2 do przemywania pozostałości po filtracji skuteczniejsze może być użycie wody gorącej zamiast zimnej.

8.5.

W przypadku niektórych pasz może być konieczne przedłużenie czasu suszenia wynoszącego 1,5 godziny. Należy jednak unikać nadmiernego suszenia, gdyż może to prowadzić do zaniżania wyników. Można również stosować kuchenki mikrofalowe.

H. OZNACZANIE WŁÓKNA SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania w paszach zawartości nietłuszczowych związków organicznych, które nie rozpuszczają się ani w środowisku kwaśnym, ani zasadowym i które zwyczajowo określa się mianem włókna surowego.

Metoda ta nie ma zastosowania w przypadku lignocelulozy i węgla roślinnego (cząstki zbyt drobne).

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbkę, w razie konieczności odtłuszczoną, poddaje się działaniu wrzących roztworów kwasu siarkowego i wodorotlenku potasu o odpowiednim stężeniu. Pozostałość jest rozdzielana przez filtrację na filtrze ze szkła spiekanego, przemywana, suszona, ważona i spopielana w temperaturze od 475 do 500 °C. Ubytek masy po spopielaniu odpowiada zawartości włókna surowego w badanej próbce.

3. Odczynniki

3.1.

Kwas siarkowy, c = 0,13 mol/l

3.2.

Substancja przeciwpieniąca (np. n-oktanol)

3.3.

Pomocniczy materiał filtracyjny (Celit 545 lub równoważny), wyprażony w temperaturze 500 °C przez cztery godziny (pkt 8.6)

3.4.

Aceton

3.5.

Eter naftowy o temperaturze wrzenia od 40 do 60 °C

3.6.

Kwas chlorowodorowy, c = 0,5 mol/l

3.7.

Roztwór wodorotlenku potasu, c = 0,23 mol/l

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Urządzenie grzewcze do mineralizacji kwasem siarkowym i roztworem wodorotlenku potasu, wyposażone w podstawkę mocującą tygiel filtracyjny (pkt 4.2) i rurkę odprowadzającą z kranem służącą do odprowadzenia cieczy i próżni, ewentualnie ze sprzężonym powietrzem. Codziennie przed użyciem podgrzewa się urządzenie, przemywając je wrzącą wodą przez pięć minut.

4.2.

Tygiel filtracyjny z filtrem ze szkła spiekanego o porach od 40 do 90 μm. Przed pierwszym użyciem ogrzewać przez kilka minut w temperaturze 500 °C i schłodzić (pkt 8.6).

4.3.

Cylinder o pojemności co najmniej 270 ml z chłodnicą zwrotną, przystosowany do gotowania

4.4.

Suszarka z termostatem

4.5.

Piec muflowy z termostatem

4.6.

Urządzenie do ekstrakcji składające się z podstawki mocującej tygiel filtracyjny (pkt 4.2) i rurki odprowadzającej z kranem, służącej do odprowadzenia cieczy i próżni

4.7.

Pierścienie łączące, służące do połączenia urządzenia grzewczego (pkt 4.1) z tyglem filtracyjnym (pkt 4.2) i cylindrem (pkt 4.3) oraz do dołączenia zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6) i tygla

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 1 g przygotowanej próbki do tygla (pkt 4.2) (zob. objaśnienia 9.1, 9.2 i 9.3) i dodać 1 g pomocniczego materiału filtracyjnego (pkt 3.3).

Połączyć urządzenie grzewcze (pkt 4.1) z tyglem filtracyjnym (pkt 4.2), a następnie dołączyć cylinder (pkt 4.3) do tygla. Wlać 150 ml wrzącego kwasu siarkowego (pkt 3.1) do cylindra połączonego z tyglem i, w razie potrzeby, dodać kilka kropli substancji przeciwpieniącej (pkt 3.2).

Doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie 5 ± 2 minut i gotować przez dokładnie 30 minut.

Otworzyć kran rurki odprowadzającej (pkt 4.1) i w warunkach próżni filtrować kwas siarkowy przez tygiel filtracyjny i przemywać pozostałość trzykrotnie 30 ml porcjami wrzącej wody, upewniając się, że pozostałość przefiltrowano do sucha po każdym przemyciu.

Zamknąć ujście kranu i wlać 150 ml wrzącego roztworu wodorotlenku potasu (pkt 3.7) do cylindra połączonego z tyglem i dodać kilka kropli substancji przeciwpieniącej (pkt 3.2). Doprowadzić ciecz do punktu wrzenia w czasie 5 ± 2 minut i gotować przez 30 minut. Przefiltrować i powtórzyć procedurę przemywania wykorzystaną w odniesieniu do kwasu siarkowego.

Po ostatnim przemyciu i wysuszeniu odłączyć tygiel i jego zawartość i podłączyć go do zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6). W warunkach próżni przemywać pozostałość w tyglu trzema kolejnymi porcjami 25 ml acetonu (pkt 3.4), upewniając się, że pozostałość przefiltrowano do sucha po każdym przemyciu.

Wysuszyć tygiel do stałej masy w suszarce o temperaturze 130 °C. Po każdym suszeniu schłodzić w eksykatorze i niezwłocznie zważyć. Umieścić tygiel w piecu muflowym i spopielać do stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 2 mg) w temperaturze od 475 do 500 °C przez co najmniej 30 minut.

Przed ważeniem, po każdym ogrzewaniu, najpierw schłodzić w piecu, a następnie w eksykatorze.

Przeprowadzić test ślepej próby bez próbki. Ubytek masy po spopielaniu nie może przekraczać 4 mg.

6. Obliczanie wyników

Procentową zawartość włókna surowego w próbce oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

m	=	masa próbki w g
m0	=	ubytek masy po spopieleniu w trakcie oznaczania, w g
m1	=	ubytek masy po spopieleniu w trakcie próby ślepej, w g

7. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

-	0,6 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości włókna surowego niższej niż 10 %,

-	6 % względem wyższego wyniku, dla zawartości włókna surowego równej lub wyższej niż 10 %.

8. Odtwarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki w różnych laboratoriach nie może przekraczać:

-	1,0 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości włókna surowego niższej niż 10 %,

-	10 % względem wyższego wyniku, dla zawartości włókna surowego równej lub wyższej niż 10 %.

9. Objaśnienia

9.1.

Pasze zawierające więcej niż 10 % tłuszczu surowego przed analizą należy odtłuścić eterem naftowym (pkt 3.5). Podłączyć tygiel filtracyjny (pkt 4.2) wraz z jego zawartością do zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6), zastosować próżnię i przemyć pozostałość trzykrotnie 30 ml porcjami eteru naftowego, upewniając się, że pozostałość jest sucha. Podłączyć tygiel wraz z jego zawartością do urządzenia grzewczego (pkt 4.1) i postępować w sposób określony w pkt 5.

9.2.

Pasze zawierające tłuszcze, które nie mogą być bezpośrednio ekstrahowane eterem naftowym (pkt 3.5), odtłuścić w sposób określony w pkt 8.1 i ponownie odtłuścić po gotowaniu z kwasem. Po gotowaniu z kwasem, a następnie przemyciu podłączyć tygiel wraz z jego zawartością do zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (pkt 4.6) i przemyć trzykrotnie 30 ml porcjami acetonu, a następnie trzykrotnie 30 ml porcjami eteru naftowego. Przefiltrować do sucha w warunkach próżni i postępować w sposób określony w pkt 5, rozpoczynając od postępowania z wodorotlenkiem potasu.

9.3.

Jeżeli pasza zawiera więcej niż 5 % węglanów, wyrażonych jako węglan wapnia, podłączyć tygiel (pkt 4.2) z odważoną próbką do urządzenia grzewczego (pkt 4.1). Przemyć próbkę trzykrotnie 30 ml porcjami kwasu chlorowodorowego (pkt 3.6). Po dodaniu każdej porcji kwasu pozostawić próbkę na około minutę przed filtrowaniem. Przemyć 30 ml wody i postępować w sposób określony w pkt 5.

9.4.

Jeżeli używana jest aparatura stojąca (kilka tygli podłączonych do jednego urządzenia grzewczego), nie należy wykonywać dwóch pojedynczych oznaczeń tej samej próbki w tej samej serii.

9.5.

Jeżeli po gotowaniu filtrowanie roztworu kwasowego i zasadowego jest trudne, przepuścić sprężone powietrze przez rurkę podłączaną do urządzenia grzewczego i następnie kontynuować filtrowanie.

9.6.

Temperatura spopielania nie może być wyższa niż 500 °C ze względu na wytrzymałość szklanego tygla filtracyjnego. Postępować w taki sposób, aby uniknąć szoku termicznego podczas ogrzewania i schładzania.

I. OZNACZANIE CUKRÓW

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości cukrów redukujących i całkowitej zawartości cukrów po inwersji, wyrażonych jako glukoza lub w razie potrzeby jako sacharoza, z zastosowaniem współczynnika 0,95. Metodę stosuje się do mieszanek paszowych. Dla innych pasz stosuje się specjalne metody. W razie potrzeby laktozę należy mierzyć oddzielnie, uwzględniając ją w obliczeniach.

Metoda ta ma być stosowana do oznaczania zawartości cukrów w celu obliczania wartości energetycznej paszy.

W przypadku gdy zawartość cukrów ma być oznaczona do innych celów, można zastosować inne metody analizy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Cukry ekstrahuje się w rozcieńczonym etanolu. Otrzymany roztwór klaruje się roztworami Carreza I i Carreza II. Po wyeliminowaniu etanolu zawartość cukrów przed i po inwersji oznacza się metodą Luff-Schoorla.

3. Odczynniki

3.1.

Etanol, roztwór 40 % (v/v), gęstość: 0,948 g/ml przy temperaturze 20 °C, obojętny wobec fenoloftaleiny

3.2.

Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn (CH3COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3.

Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4 Fe (CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4.

Roztwór 0,1 % (w/v) oranżu metylowego

3.5.

Kwas chlorowodorowy, 4 mol/l

3.6.

Kwas chlorowodorowy, 0,1 mol/l

3.7.

Roztwór wodorotlenku sodu, 0,1 mol/l

3.8.

Odczynnik Luff-Schoorla: Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (pkt 3.8.2) do roztworu węglanu sodu (pkt 3.8.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (pkt 3.8.1) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. Zostawić na noc do osadzenia i przefiltrować. Sprawdzić stężenie otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), zob. pkt 5.4 akapit ostatni. Wartość pH roztworu musi wynosić około 9,4.

3.8.1.

Roztwór siarczanu miedzi: rozpuścić 25 g siarczanu miedzi Cu SO4 5H2O, wolnego od żelaza, w 100 ml wody.

3.8.2.

Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego, C6H8O7•H2O w 50 ml wody.

3.8.3.

Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w około 300 ml ciepłej wody. Pozostawić do schłodzenia.

3.9.

Roztwór tiosiarczanu sodu, 0,1 mol/l

3.10.

Roztwór skrobi: do 1 litra wrzącej wody dodać 5 g skrobi rozpuszczonej w 30 ml wody. Gotować trzy minuty, pozostawić do schłodzenia, a jeżeli to konieczne, dodać 10 mg jodku rtęci jako środka konserwującego.

3.11.

Kwas siarkowy, 3 mol/l

3.12.

30 % roztwór jodku potasu (w/v)

3.13.

Granulki kamienia pumeksowego gotowane w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.14.

3-metylobutan-1-ol

4. Aparatura i sprzęt

Mikser (tumbler): ok. 35-40 obr./min

5. Sposób postępowania

5.1. Ekstrakcja próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 200 ml etanolu (pkt 3.1) i mieszać w tumblerze przez godzinę. Dodać 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.2) i mieszać przez ok. 30 sekund. Dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.3) i ponownie mieszać przez minutę. Uzupełnić do pełnej objętości kolby etanolem (pkt 3.1), zhomogenizować i przefiltrować. Pobrać 200 ml filtratu i odparować do około połowy objętości w celu usunięcia większości etanolu. Przenieść ilościowo pozostałość po odparowaniu do kolby miarowej o pojemności 200 ml z użyciem ciepłej wody, schłodzić, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zhomogenizować i, jeżeli to konieczne, przefiltrować. Roztwór ten będzie użyty do oznaczenia zawartości cukrów redukujących i, po inwersji, całkowitej zawartości cukrów.

5.2. Oznaczanie cukrów redukujących

Używając pipety, pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza. Jeżeli to konieczne, uzupełnić do objętości 25 ml wodą destylowaną i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy w próbce.

5.3. Oznaczanie całkowitej zawartości cukru po inwersji

Używając pipety, pobrać 50 ml roztworu i przenieść go do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Dodać kilka kropli roztworu oranżu metylowego (pkt 3.4) i następnie, ciągle mieszając, dodawać ostrożnie kwas chlorowodorowy (pkt 3.5) aż do zmiany barwy cieczy na mocno czerwoną. Dodać 15 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.6) i zanurzyć kolbę we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Szybko schłodzić do temperatury około 20 °C i dodać 15 ml roztworu wodorotlenku sodu (pkt 3.7). Uzupełnić kolbę do objętości 100 ml wodą i zhomogenizować. Pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza. Jeżeli to konieczne, uzupełnić do objętości 25 ml wodą destylowaną i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy lub, w stosownych przypadkach, sacharozy, mnożąc przez współczynnik 0,95.

5.4. Miareczkowanie metodą Luff-Schoorla

Odmierzyć pipetą 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.8) i przenieść do kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml; dodać dokładnie 25 ml klarownego roztworu cukru. Dodać dwie granulki kamienia pumeksowego (pkt 3.13), ogrzewać nad średnim płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie około dwóch minut. Natychmiast postawić kolbę Erlenmeyera na siatce azbestowej z otworem o średnicy około 6 cm, pod którym pali się płomień. Płomień należy ustawić tak, aby ogrzewane było tylko dno kolby Erlenmeyera. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera. Gotować dokładnie 10 minut. Schłodzić natychmiast zimną wodą i po około pięciu minutach miareczkować w następujący sposób:

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.12) i od razu po tej czynności (zachowując ostrożność ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.11). Miareczkować roztworem tiosiarczanu sodu (pkt 3.9) do pojawienia się mętnej żółtej barwy, dodać wskaźnik skrobiowy (pkt 3.10) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie na mieszaninie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.8) i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.12) i 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.11), bez gotowania.

6. Obliczanie wyników

Wykorzystując tabelę, określić ilość glukozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami dwóch miareczkowań, wyrażonych w ml tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Postępowanie specjalne

7.1.

W przypadku pasz bogatych w melasę i innych pasz, które nie są szczególnie jednorodne, odważyć 20 g próbki i umieścić z 500 ml wody w kolbie miarowej o pojemności 1 l. Mieszać przez godzinę w tumblerze. Sklarować roztworami Carreza I (pkt 3.2) i II (pkt 3.3) w sposób określony w pkt 5.1, z użyciem czterokrotnie większych ilości każdego odczynnika. Uzupełnić kolbę do objętości 80 % etanolem (v/v). Zhomogenizować i przefiltrować. Usunąć etanol w sposób określony w pkt 5.1. Jeżeli nie ma dekstrynizowanej skrobi, uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą destylowaną.

7.2.

W przypadku melasy i materiałów paszowych bogatych w cukier i prawie wolnych od skrobi (np. chleb świętojański, suszone krajane buraki ćwikłowe itp.), odważyć 5 g próbki, umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml, dodać 200 ml wody destylowanej, mieszać w tumblerze przez godzinę lub, jeśli to konieczne, dłużej. Roztwór klarować roztworami Carreza I (3.2) i II (pkt 3.3) w sposób określony w pkt 5.1. Uzupełnić do pełnej objętości kolby zimną wodą, zhomogenizować i przefiltrować. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3 w celu określenia całkowitej zawartości cukrów.

8. Objaśnienia

8.1.

Aby zapobiec powstawaniu piany, wskazane jest dodanie (niezależnie od objętości) około 1 ml 3-metylobutan-1-olu (pkt 3.14) przed gotowaniem z odczynnikiem Luff-Schoorla.

8.2.

Różnica pomiędzy zawartością całkowitą cukrów po inwersji, wyrażonych jako glukoza, a zawartością cukrów redukujących, wyrażonych jako glukoza, pomnożona przez 0,95 daje procentową zawartość sacharozy.

8.3.

Aby oznaczyć zawartość cukrów redukujących, z wyłączeniem laktozy, można zastosować dwie następujące metody:

8.3.1.

Dla szacunkowych obliczeń pomnożyć zawartość laktozy oznaczoną inną metodą przez 0,675 i uzyskany wynik odjąć od zawartości cukrów redukujących.

8.3.2.

Aby dokładnie obliczyć zawartość cukrów redukujących, z wyłączeniem laktozy, ta sama próbka musi być użyta do dwóch końcowych oznaczeń. Jedną analizę przeprowadza się na części roztworu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1, drugą na części roztworu otrzymanego podczas oznaczania laktozy metodą służącą do jej oznaczania (po fermentacji innych rodzajów cukrów i sklarowaniu). W obu przypadkach ilość cukru jest oznaczana metodą Luff-Schoorla i przeliczana na mg glukozy. Jedna wartość jest odejmowana od drugiej, a różnica jest wyrażana jako udział procentowy w próbce. Przykład Dwie pobrane objętości odpowiadają próbce o masie 250 mg dla każdego oznaczenia. W pierwszym przypadku zużyte zostało 17 ml roztworu tiosiarczanu sodu o stężeniu 0,1 mol/l, co odpowiada 44,2 mg glukozy, w drugim przypadku 11 ml odpowiada 27,6 mg glukozy. Różnica wynosi 16,6 mg glukozy. Zawartość cukrów redukujących (z wyłączeniem laktozy), w przeliczeniu na glukozę, wynosi zatem: Tabela wartości dla 25 ml odczynnika Luff-Schoorla ml Na2 S2 O3 0,1 mol/l, podgrzewanie przez dwie minuty, gotowanie przez 10 minut Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glukoza, fruktoza, cukry inwertowane C6 H12 O6 Laktoza C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg różnica mg różnica ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J. OZNACZANIE LAKTOZY

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości laktozy w paszach zawierających ponad 0,5 % laktozy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Cukry są rozpuszczane w wodzie. Roztwór jest poddawany fermentacji w obecności drożdży Saccharomyces cerevisiae, które nie rozkładają laktozy. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu zawartość laktozy w filtracie jest oznaczana metodą Luff-Schoorla.

3. Odczynniki

3.1.

Zawiesina Saccharomyces cerevisiae: 25 g świeżych drożdży umieścić w 100 ml wody. Zawiesinę przechowywać w lodówce nie dłużej niż przez tydzień od jej sporządzenia.

3.2.

Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn (CH3 COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3.

Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4 Fe (CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4.

Odczynnik Luff-Schoorla: Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (pkt 3.4.2) do roztworu węglanu sodu (pkt 3.4.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (pkt 3.4.1) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. Zostawić na noc do osadzenia i przefiltrować. Sprawdzić stężenie otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l). Wartość pH roztworu musi wynosić około 9,4.

3.4.1.

Roztwór siarczanu miedzi: rozpuścić 25 g siarczanu miedzi Cu SO4 5H2O wolnego od żelaza w 100 ml wody.

3.4.2.

Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego C6H8O7 • H2O w 50 ml wody.

3.4.3.

Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w około 300 ml ciepłej wody. Pozostawić do schłodzenia.

3.5.

Granulki kamienia pumeksowego gotowane w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.6.

30 % roztwór jodku potasu (w/v)

3.7.

Kwas siarkowy, 3 mol/l

3.8.

Roztwór tiosiarczanu sodu, 0,1 mol/l

3.9.

Roztwór skrobi: do 1 litra wrzącej wody dodać 5 g skrobi rozpuszczonej w 30 ml wody. Gotować trzy minuty, pozostawić do schłodzenia, a jeżeli to konieczne, dodać 10 mg jodku rtęci jako środka konserwującego.

4. Aparatura i sprzęt

Łaźnia wodna z termostatem umożliwiającym utrzymanie temperatury od 38 do 40 °C.

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 1 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać od 25 do 30 ml wody. Wstawić kolbę do wrzącej łaźni wodnej na 30 minut, a następnie ostudzić do temperatury około 35 °C. Dodać 5 ml zawiesiny drożdży (pkt 3.1) i zhomogenizować. Pozostawić kolbę na dwie godziny w łaźni wodnej o temperaturze od 38 do 40 °C. Schłodzić do temperatury około 20 °C.

Dodać 2,5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.2) i mieszać przez 30 sekund, następnie dodać 2,5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.3) i ponownie mieszać przez 30 sekund. Uzupełnić kolbę do objętości 100 ml wodą, zmieszać i przefiltrować. Używając pipety, pobrać nie więcej niż 25 ml filtratu, który powinien zawierać od 40 do 80 mg laktozy, i umieścić go w kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml. W miarę potrzeby uzupełnić do objętości 25 ml wodą.

W ten sam sposób przeprowadzić próbę ślepą z 5 ml zawiesiny drożdży (pkt 3.1). Oznaczyć zawartość laktozy według Luff-Schoorla, w następujący sposób: dodać 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.4) i dwie granulki kamienia pumeksowego (pkt 3.5). Ogrzewać nad średnim płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w czasie około dwóch minut. Natychmiast postawić kolbę Erlenmeyera na siatce azbestowej z otworem o średnicy około 6 cm, pod którym pali się płomień. Płomień należy ustawić tak, aby ogrzewane było tylko dno kolby Erlenmeyera. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera. Gotować dokładnie 10 minut. Schłodzić natychmiast zimną wodą i po około pięciu minutach miareczkować w następujący sposób:

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.6) i niezwłocznie (zachowując ostrożność ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.7). Miareczkować roztworem tiosiarczanu sodu (pkt 3.8) do pojawienia się mętnej żółtej barwy, dodać wskaźnik skrobiowy (pkt 3.9) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie na mieszaninie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (pkt 3.4) i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml roztworu jodku potasu (pkt 3.6) i 25 ml kwasu siarkowego (pkt 3.7), bez gotowania.

6. Obliczanie wyników

Wykorzystując załączoną tabelę, określić ilość laktozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami dwóch miareczkowań, wyrażonych w ml tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l.

Wynik wyrazić jako udział procentowy bezwodnej laktozy w próbce.

7. Objaśnienia

1.

W przypadku produktów zawierających ponad 40 % cukrów fermentujących dodać więcej niż 5 ml zawiesiny drożdży (pkt 3.1).

2.

W paszach o obniżonej zawartości laktozy (np. w mleku dla kotów) laktozę przekształca się we fruktozę, która nie jest całkowicie sfermentowana w ciągu 2 godzin, co daje wyższe lub fałszywie pozytywne wyniki (ponieważ pozostałości fruktozy pozostają w ekstrakcie). Tabela wartości dla 25 ml odczynnika Luff-Schoorla ml Na2 S2 O3 0,1 mol/l, podgrzewanie przez dwie minuty, gotowanie przez 10 minut Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glukoza, fruktoza, cukry inwertowane C6 H12 O6 Laktoza C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg różnica mg różnica ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K. OZNACZANIE SKROBI

- METODA POLARYMETRYCZNA -

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości skrobi i wysokocząsteczkowych produktów jej degradacji w paszach w celu sprawdzenia zgodności z zadeklarowaną wartością energetyczną (przepisy zawarte w załączniku VII) oraz rozporządzeniem (WE) nr 767/2009.

Metoda ta ma być stosowana do oznaczania zawartości skrobi w celu obliczania wartości energetycznej paszy.

W przypadku gdy zawartość skrobi ma być oznaczona do innych celów, można zastosować inne metody analizy.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Metoda składa się z dwóch oznaczeń. W pierwszym oznaczeniu próbka jest traktowana rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się polarymetrycznie skręcalność optyczną roztworu.

W drugim oznaczeniu próbka jest ekstrahowana 40 % etanolem. Po zakwaszeniu filtratu kwasem chlorowodorowym, sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się skręcalność optyczną, tak jak w pierwszym oznaczeniu.

Różnica pomiędzy dwoma pomiarami, pomnożona przez znany współczynnik, daje zawartość skrobi w próbce.

3. Odczynniki

3.1.

Kwas chlorowodorowy, roztwór 25 % (w/w), gęstość: 1,126 g/ml

3.2.

Kwas chlorowodorowy, roztwór 1,13 % (w/v) Stężenie należy sprawdzić poprzez miareczkowanie przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu 0,1 mol/l w obecności czerwieni metylowej 0,1 % (w/v) w 94 % (v/v) etanolu. Do neutralizacji 10 ml potrzeba 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

3.3.

Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4.

Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4 Fe(CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.5.

Etanol, roztwór 40 % (v/v), gęstość: 0,948 g/ml w temperaturze 20 °C

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Kolba Erlenmeyera o pojemności 250 ml ze szlifem szklanym i chłodnicą zwrotną

4.2.

Polarymetr lub sacharymetr

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm.

5.2. Oznaczanie całkowitej skręcalności optycznej (P lub S) (zob. objaśnienia 7.1)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g rozdrobnionej próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.2), wstrząsnąć do równomiernego rozprowadzenia badanej próbki i dodać następną porcję 25 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.2). Kolbę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Aby zapobiec aglomeracji, przez pierwsze trzy minuty nieprzerwanie i energicznie wstrząsać kolbą. Ilość wody w łaźni wodnej musi być wystarczająca, aby pozostała ona w stanie wrzenia, kiedy kolba zostanie do niej włożona. Nie należy wyjmować kolby z wody w trakcie wstrząsania. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę z łaźni wodnej, dodać 30 ml zimnej wody i natychmiast schłodzić do temperatury 20 °C.

Dodać 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.3) i wstrząsać przez ok. 30 sekund. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.4) i ponownie wstrząsać przez ok. 30 sekund. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zmieszać i przefiltrować. W przypadku gdy filtrat nie jest idealnie klarowny (co zdarza się rzadko), powtórzyć oznaczanie z użyciem większej ilości roztworów Carreza I i II, np. 10 ml.

Zmierzyć skręcalność optyczną roztworu w 200 mm rurce przy zastosowaniu polarymetru lub sacharymetru.

5.3. Oznaczanie skręcalności optycznej (P' lub S') substancji rozpuszczonych w 40 % etanolu

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml i dodać około 80 ml etanolu (3.5) (zob. objaśnienia 7.2). Pozostawić kolbę na godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie sześciokrotnie energicznie wytrząsnąć kolbą, tak aby badana próbka została dobrze zmieszana z etanolem. Uzupełnić do pełnej objętości kolby etanolem (pkt 3.5), zmieszać i przefiltrować.

Pobrać pipetą 50 ml filtratu (co jest równe 2,5 g próbki) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, dodać 2,1 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) i energicznie wstrząsnąć. Dopasować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera i kolbę tę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Po dokładnie 15 minutach wyjąć kolbę Erlenmeyera z łaźni, przenieść zawartość do kolby miarowej o pojemności 100 ml, spłukując kolbę Erlenmeyera niewielką ilością zimnej wody, i schłodzić do temperatury 20 °C.

Sklarować z użyciem roztworów Carreza I (pkt 3.3) i Carreza II (pkt 3.4), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, zmieszać, przefiltrować i zmierzyć skręcalność optyczną w sposób określony w pkt 5.2 akapity drugi i trzeci.

6. Obliczanie wyników

Zawartość skrobi (w %) oblicza się według następujących wzorów:

6.1. Pomiary z użyciem polarymetru

P	=	całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowych
P'	=	skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczonych w 40 % (V/V) etanolu
	=	skręcalność właściwa czystej skrobi. Wartości liczbowe przyjęte dla tego współczynnika są następujące:

+ 185,9°	:	skrobia ryżowa
+ 185,7°	:	skrobia ziemniaczana
+ 184,6°	:	skrobia kukurydziana
+ 182,7°	:	skrobia pszenna
+ 181,5°	:	skrobia jęczmienna
+ 181,3°	:	skrobia owsiana
+ 184,0°	:	inne typy skrobi i jej mieszaniny w mieszankach paszowych

6.2. Pomiary z użyciem sacharymetru

S	=	całkowita skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych
S'	=	skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych substancji rozpuszczonych w 40 % (v/v) etanolu
N	=	masa w g sacharozy w 100 ml wody ulegająca skręcalności optycznej 100 stopni sacharymetrycznych podczas pomiaru z użyciem rurki o długości 200 mm 16,29 g dla sacharymetrów francuskich 26,00 g dla sacharymetrów niemieckich 20,00 g dla sacharymetrów połączonych
	=	skręcalność właściwa czystej skrobi (zob. pkt 6.1)

6.3. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości skrobi niższej niż 40 % i 1 % względem zawartości skrobi równej lub wyższej niż 40 %.

7. Objaśnienia

7.1.

Jeżeli próbka zawiera więcej niż 6 % węglanów, w przeliczeniu na węglan wapnia, należy rozłożyć je przy użyciu odpowiedniej ilości rozcieńczonego kwasu siarkowego przed określeniem całkowitej skręcalności optycznej.

7.2.

W przypadku produktów o dużej zawartości laktozy, takich jak serwatka w proszku lub mleko odtłuszczone w proszku, postępować w następujący sposób: po dodaniu 80 ml etanolu (pkt 3.5) dopasować chłodnicę zwrotną do kolby i kolbę tę zanurzyć w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 30 minut. Pozostawić do schłodzenia i kontynuować analizę w sposób określony w pkt 5.3.

7.3.

Następujące materiały paszowe - w przypadku obecności w znacznych ilościach w paszy - powodują interferencje podczas określania zawartości skrobi metodą polarymetryczną i mogą wpływać na otrzymywanie nieprawidłowych wyników: - produkty z buraków cukrowych, takie jak wysłodki buraczane, melasa buraczana, wysłodki buraczane melasowane, wywar melasowy z buraków (cukrowych), cukier (buraczany), - miazga (pulpa, wysłodki) cytrusowa, - siemię lniane, wytłoki z siemienia lnianego, siemię lniane ekstrahowane, - nasiona rzepaku, makuch rzepakowy, ekstrahowane nasiona rzepaku, łuski nasion rzepaku, - nasiona słonecznika, ekstrahowane nasiona słonecznika, nasiona słonecznika częściowo łuskane, ekstrahowane, - wytłoki z kopry, kopra ekstrahowana, - miazga (pulpa) ziemniaczana, - drożdże odwodnione, - produkty bogate w inulinę, a w szczególności krajanka i mączka z karczochów jerozolimskich, - skwarki, - produkty sojowe. W takich przypadkach można zastosować metodę analizy przewidzianą w rozporządzeniu Komisji (WE) nr 121/2008 (7). Metoda ta może być również stosowana w paszy zawierającej mniej niż 1 % skrobi.

L. OZNACZANIE POPIOŁU SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości popiołu surowego w paszach.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest spopielana w temperaturze 550 °C, a pozostałość jest ważona.

3. Odczynniki

20 % roztwór azotanu amonu (w/v)

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Płyta grzejna

4.2.

Elektryczny piec muflowy z termostatem

4.3.

Krzemionkowe, porcelanowe lub platynowe tygle do spalań, prostokątne (ok. 60 × 40 × 25 mm) lub okrągłe (średnica: 60-75 mm, wysokość: 20-40 mm).

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki (2,5 w przypadku substancji pęczniejących) i umieścić w tyglu do spalań, który został podgrzany do temperatury 550 °C, schłodzony i wytarowany. Tygiel postawić na płycie grzejnej i ogrzewać stopniowo aż do zwęglenia substancji. Spopielić zgodnie z pkt 5.1 lub 5.2.

5.1.

Wstawić tygiel do skalibrowanego pieca muflowego o temperaturze ustawionej na 550 °C. Utrzymywać w tej temperaturze aż do uzyskania popiołu o barwie białej, jasnoszarej lub czerwonawej, w którym nie widać cząstek zawierających węgiel. Umieścić tygiel w eksykatorze, pozostawić do schłodzenia i niezwłocznie zważyć.

5.2.

Wstawić tygiel do skalibrowanego pieca muflowego o temperaturze ustawionej na 550 °C. Spopielać przez 3 godziny. Umieścić tygiel w eksykatorze, pozostawić do schłodzenia i niezwłocznie zważyć. Ponownie spopielać przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy popiołu (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 1 mg).

6. Obliczanie wyników

Masę pozostałości obliczyć, odejmując tarę.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Objaśnienia

7.1.

Substancje, które trudno się spopielają, należy wstępnie spopielać co najmniej przez trzy godziny, schłodzić, a następnie dodać do nich - ostrożnie, w taki sposób, aby nie spowodować strat popiołu i tworzenia się zbryleń - kilka kropli 20 % roztworu azotanu amonu lub wody. Po wysuszeniu kontynuować zwęglanie w piecu. Powtarzać czynności w razie potrzeby aż do całkowitego spopielenia.

7.2.

W przypadku substancji, które trudno poddają się postępowaniu określonemu w pkt 7.1, postępuje się w następujący sposób: po spopielaniu przez trzy godziny popiół umieścić w ciepłej wodzie i przefiltrować przez mały, bezpopiołowy filtr. Spopielić filtr z zawartością w tyglu. Filtrat umieścić w schłodzonym tyglu, odparować do wyschnięcia, spopielić i zważyć.

7.3.

W przypadku olejów i tłuszczów należy dokładnie odważyć próbkę o masie 25 g i umieścić ją w tyglu o odpowiedniej wielkości. Zwęglić, przenosząc płomień na substancję skrawkiem sączka bezpopiołowego. Po spaleniu pozostałość zwilżyć jak najmniejszą ilością wody. Wysuszyć i spopielać w sposób określony w pkt 5.

M. OZNACZANIE POPIOŁU NIEROZPUSZCZALNEGO W KWASIE CHLOROWODOROWYM

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości substancji mineralnych nierozpuszczalnych w kwasie chlorowodorowym w paszach. W zależności od rodzaju próbki stosuje się dwie metody.

1.1.

Metoda A: mająca zastosowanie do organicznych materiałów paszowych i do większości mieszanek paszowych;

1.2.

Metoda B: mająca zastosowanie do mieszanek paszowych i mieszanin mineralnych oraz do mieszanek paszowych zawierających substancje nierozpuszczalne w kwasie chlorowodorowym w ilości wyższej niż 1 %, co sprawdza się, stosując wcześniej metodę A.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1.

Metoda A: próbka jest spopielana, popiół gotowany w kwasie chlorowodorowym, a nierozpuszczalna pozostałość jest filtrowana i ważona.

2.2.

Metoda B: próbka jest traktowana kwasem chlorowodorowym. Roztwór się filtruje, pozostałość spopiela i z otrzymanym popiołem postępuje się w sposób opisany w metodzie A.

3. Odczynniki

3.1.

Kwas chlorowodorowy, 3 mol/l

3.2.

20 % roztwór kwasu trichlorooctowego (w/v)

3.3.

1 % roztwór kwasu trichlorooctowego (w/v)

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Płyta grzejna

4.2.

Elektryczny piec muflowy z termostatem

4.3.

Krzemionkowe, porcelanowe lub platynowe tygle do spalań, prostokątne (ok. 60 × 40 × 25 mm) lub okrągłe (średnica: 60-75 mm, wysokość: 20-40 mm)

4.4.

Filtry bezpopiołowe

5. Sposób postępowania

5.1. Metoda A:

Spopielić próbkę metodą opisaną w odniesieniu do oznaczania popiołu surowego. Popiół uzyskany w wyniku zastosowanej analizy może być także wykorzystany do badania.

Popiół przenieść do zlewki o pojemności od 250 do 400 ml z użyciem 75 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1). Powoli doprowadzić do wrzenia i gotować ostrożnie przez 15 minut. Przefiltrować ciepły roztwór przez sączek bezpopiołowy i przemywać pozostałość gorącą wodą, aż reakcja z kwasem przestanie być widoczna. Wysuszyć filtr zawierający pozostałość i spopielić go w wytarowanym tyglu w temperaturze nie niższej niż 550 °C i nie wyższej niż 700 °C. Ochłodzić w eksykatorze i zważyć.

5.2. Metoda B

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki i umieścić w zlewce o pojemności od 250 do 400 ml. Dodać kolejno 25 ml wody i 25 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1), wymieszać i odczekać, aż roztwór przestanie się burzyć. Dodać kolejne 50 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1). Odczekać do ulotnienia się gazu, następnie umieścić zlewkę we wrzącej łaźni wodnej i trzymać ją tam przez co najmniej 30 minut, w celu całkowitej hydrolizy skrobi. Ciepły roztwór przefiltrować przez sączek bezpopiołowy i przemyć go 50 ml ciepłej wody (zob. objaśnienia pkt 7). Filtr z pozostałością umieścić w tyglu do spalań, wysuszyć i spopielać w temperaturze nie niższej niż 550 °C i nie wyższej niż 700 °C. Popiół przenieść do zlewki o pojemności od 250 do 400 ml z użyciem 75 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1). Kontynuować czynności opisane w pkt 5.1 akapit drugi.

6. Obliczanie wyników

Masę pozostałości obliczyć, odejmując tarę. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Objaśnienia

Jeżeli filtracja ma trudny przebieg, zaleca się powtórne przeprowadzenie analizy, zastępując 50 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.1) 50 ml roztworu 20 % (w/v) kwasu trichlorooctowego (pkt 3.2) i przemywając filtr ciepłym 1 % roztworem kwasu trichlorooctowego (pkt 3.3).

N. OZNACZANIE CAŁKOWITEJ ZAWARTOŚCI FOSFORU

Fosfor całkowity ma być oznaczany z wykorzystaniem:

-	metody analizy przewidzianej w normie EN 15510 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz - Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, żelaza, cynku, miedzi, manganu, kobaltu, molibdenu i ołowiu z zastosowaniem ICP-AES lub

-	metody analizy przewidzianej w normie EN 15621 Pasze: Metody pobierania próbek i analiz - Oznaczanie wapnia, sodu, fosforu, magnezu, potasu, siarki, żelaza, cynku, miedzi, manganu i kobaltu po mineralizacji ciśnieniowej metodą ICP-AES lub

-	metody fotometrycznej, jak opisano poniżej.

METODA FOTOMETRYCZNA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania całkowitej zawartości fosforu w paszy. Metoda ta jest w szczególności odpowiednia do analizy paszy o niskiej zawartości fosforu. W niektórych przypadkach (produkty bogate w fosfor) dopuszcza się stosowanie metody grawimetrycznej.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana poprzez suche spalanie (w przypadku pasz organicznych) lub przez rozpuszczenie kwasem (w przypadku związków mineralnych i pasz płynnych), a następnie wprowadzana do kwaśnego roztworu. Roztwór jest traktowany odczynnikiem molibdenowanadowym. Gęstość optyczna utworzonego żółtego roztworu jest mierzona w spektrofotometrze przy 430 nm.

3. Odczynniki

3.1.

Węglan wapnia

3.2.

Kwas chlorowodorowy, ρ20 = 1,10 g/ml (ok. 6 mol/l)

3.3.

Kwas azotowy, ρ20 = 1,045 g/ml

3.4.

Kwas azotowy, ρ20 = od 1,38 do 1,42 g/ml

3.5.

Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml

3.6.

Odczynnik molibdenowanadowy: zmieszać 200 ml roztworu heptamolibdenianu amonu (pkt 3.6.1), 200 ml roztworu metawanadanu amonu (pkt 3.6.2) i 134 ml kwasu azotowego (pkt 3.4) w kolbie miarowej o pojemności 1 l. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą.

3.6.1.

Roztwór heptamolibdenianu amonu: rozpuścić w gorącej wodzie 100 g heptamolibdenianu amonu (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Dodać 10 ml amoniaku (o gęstości 0,91 g/ml) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.6.2.

Roztwór metawanadanu amonu: 2,35 g metawanadanu amonu NH4VO3 rozpuścić w 400 ml gorącej wody. Stale mieszając, dodawać powoli 20 ml rozcieńczonego kwasu azotowego (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.7.

Roztwór wzorcowy fosforu o stężeniu 1 mg/ml: rozpuścić 4,387 g diwodorofosforanu potasu KH2PO4w wodzie. Uzupełnić do objętości 1 l wodą.

4. Aparatura i sprzęt

4.1.

Krzemionkowe, porcelanowe lub platynowe tygle do spopielania

4.2.

Elektryczny piec muflowy z termostatem nastawionym na temperaturę 550 °C

4.3.

Kolba Kjeldahla o pojemności 250 ml

4.4.

Kolby i pipety miarowe

4.5.

Spektrofotometr

4.6.

Probówki o średnicy około 16 mm i pojemności od 25 do 30 ml z korkami stopniowanymi do średnicy 14,5 mm

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie roztworu

W zależności od rodzaju próbki przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.1 lub 5.1.2.

5.1.1. Zwykły sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, co najmniej 1 g próbki. Umieścić badaną próbkę w kolbie Kjeldahla, dodać 20 ml kwasu siarkowego (3.5), wstrząsnąć do całkowitego nasycenia kwasem i nie dopuścić do przyklejania cząstek do ścianek kolby, podgrzać i utrzymywać w temperaturze wrzenia przez 10 minut. Nieznacznie schłodzić, dodać 2 ml kwasu azotowego (pkt 3.4), ostrożnie podgrzać, ponownie nieznacznie schłodzić i dodać nieco więcej kwasu azotowego (pkt 3.4), a następnie ponownie doprowadzić do wrzenia. Powtarzać te czynności aż do uzyskania bezbarwnego roztworu. Schłodzić, dodać trochę wody, zdekantować ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukać kolbę Kjeldahla gorącą wodą. Pozostawić do schłodzenia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, zhomogenizować i przefiltrować.

5.1.2. Próbki zawierające substancje organiczne, wolne od diwodorofosforanów magnezu i wapnia

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 2,5 g próbki i umieścić w tyglu do spopielania. Zmieszać dokładnie próbkę badaną z 1 g węglanu wapnia (pkt 3.1). Spopielać w piecu w temperaturze 550 °C do uzyskania popiołu o białej lub szarej barwie (niewielka ilość węgla drzewnego nie ma znaczenia). Przenieść popiół do zlewki o pojemności 250 ml. Dodać 20 ml wody i kwasu chlorowodorowego (pkt 3.2) aż do zaprzestania pienienia się. Następnie dodać kolejne 10 ml kwasu chlorowodorowego (pkt 3.2). Umieścić zlewkę na łaźni piaskowej i odparować do wyschnięcia, aby uczynić krzemionkę nierozpuszczalną. Pozostałość rozpuścić w 10 ml kwasu azotowego (pkt 3.3) i gotować na łaźni piaskowej lub płycie grzejnej przez 5 minut, nie doprowadzając do zupełnego odparowania cieczy. Zdekantować ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukując kilkakrotnie zlewkę gorącą wodą. Pozostawić do schłodzenia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, zhomogenizować i przefiltrować.

5.2. Wywołanie zabarwienia i pomiar gęstości optycznej

Rozcieńczyć podwielokrotną część filtratu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1.1 lub 5.1.2 do uzyskania stężenia fosforu nie większego niż 40 μg/ml. Umieścić 10 ml tego roztworu w probówce (pkt 4.6) i dodać 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (pkt 3.6). Homogenizować i pozostawić co najmniej na 10 minut w temperaturze 20 °C. Zmierzyć gęstość optyczną w spektrofotometrze przy 430 nm w stosunku do roztworu otrzymanego przez dodanie 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (pkt 3.6) do 10 ml wody.

5.3. Krzywa wzorcowa

Z roztworu wzorcowego (pkt 3.7) przygotować roztwory zawierające odpowiednio 5, 10, 20, 30 i 40 μg fosforu w 1 ml. Pobrać 10 ml każdego z tych roztworów i dodać do nich po 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (pkt 3.6). Zhomogenizować i pozostawić co najmniej na 10 minut w temperaturze 20 °C. Zmierzyć gęstość optyczną w sposób określony w pkt 5.2. Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając wartości gęstości optycznej w stosunku do odpowiadających jej ilości fosforu. W zakresie stężeń od 0 do 40 μg/ml krzywa jest liniowa.

6. Obliczanie wyników

Określić zawartość fosforu w badanej próbce z zastosowaniem krzywej wzorcowej.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

-	3 % względem wyższego wyniku, dla zawartości fosforu niższej niż 5 %,

-	0,15 % w wartości bezwzględnej, dla zawartości fosforu równej lub wyższej niż 5 %.

O. OZNACZANIE CHLORU Z CHLORKÓW

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości chloru w chlorkach, które są rozpuszczalne w wodzie, umownie wyrażanego jako chlorek sodu. Metodę tę stosuje się do wszystkich pasz.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Chlorki są rozpuszczane w wodzie. Jeżeli badany produkt zawiera substancje organiczne, roztwór jest klarowany. Po nieznacznym zakwaszeniu kwasem azotowym chlorki strąca się w postaci chlorku srebra przy użyciu roztworu azotanu srebra. Nadmiar azotanu srebra jest miareczkowany roztworem tiocyjanianu amonu według metody Volharda.

3. Odczynniki

3.1.

Roztwór tiocyjanianu amonu 0,1 mol/l

3.2.

Roztwór azotanu srebra 0,1 mol/l

3.3.

Nasycony roztwór siarczanu amonu i żelaza (NH4)Fe(SO4)2

3.4.

Kwas azotowy, gęstość: 1,38 g/ml

3.5.

Eter dietylowy

3.6.

Aceton

3.7.

Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn (CH3COO)2·2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.8.

Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasu K4Fe(CN)6·3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.9.

Węgiel aktywny, wolny od chlorków i nieabsorbujący chlorków

4. Aparatura i sprzęt

Mikser (tumbler): ok. 35-40 obr./min

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie roztworu

Zależnie od rodzaju próbki, przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3.

W tym samym czasie przeprowadzić próbę ślepą, pomijając analizowaną próbkę.

5.1.1. Próbki niezawierające substancji organicznej

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, nie więcej niż 10 g próbki zawierającej nie więcej niż 3 g chloru w postaci chlorków. Odważkę umieścić z 400 ml wody o temperaturze około 20 °C w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Mieszać przez 30 minut w tumblerze, uzupełnić do pełnej objętości kolby, zhomogenizować i przefiltrować.

5.1.2. Próbki zawierające substancje organiczne, z wyłączeniem produktów wymienionych w pkt 5.1.3

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i wraz z 1 g węgla aktywnego umieścić w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody o temperaturze około 20 °C i 5 ml roztworu Carreza I (pkt 3.7), mieszać przez 30 sekund i dodać 5 ml roztworu Carreza II (pkt 3.8). Mieszać przez 30 minut w tumblerze, uzupełnić do pełnej objętości kolby, zhomogenizować i przefiltrować.

5.1.3. Pasze po obróbce cieplnej, makuchy lniane, mączka lniana, produkty bogate w mączkę lnianą i inne produkty bogate w śluz lub substancje koloidalne (np. dekstrynizowana skrobia)

Przygotować roztwór w sposób określony w pkt 5.1.2, ale nie filtrować. Zdekantować (w razie potrzeby odwirować), pobrać 100 ml płynnego supernatantu i przenieść go do kolby miarowej o pojemności 200 ml. Zmieszać z acetonem (pkt 3.6) i uzupełnić do pełnej objętości kolby tym rozpuszczalnikiem, zhomogenizować i przefiltrować.

5.2. Miareczkowanie

W zależności od przewidywanej zawartości chlorku przenieść pipetą do kolby Erlenmeyera od 25 do 100 ml filtratu, otrzymanego w sposób określony w pkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3. Podwielokrotna część nie może zawierać więcej niż 150 mg chloru (Cl). Rozcieńczyć w razie potrzeby wodą do objętości nie mniejszej niż 50 ml, dodać 5 ml kwasu azotowego (pkt 3.4), 2 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu i żelaza (pkt 3.3) i dwie krople roztworu tiocyjanianu amonu (pkt 3.1) przeniesionego z zastosowaniem biurety wypełnionej do znaku 0. Stosując biuretę, przenieść roztwór azotanu srebra (pkt 3.2), tak aby nadmiar wyniósł 5 ml. Dodać 5 ml eteru dietylowego (pkt 3.5) i mocno wstrząsać do skoagulowania się osadu. Nadmiar azotanu srebra miareczkować roztworem tiocyjanianu amonu (pkt 3.1) aż do uzyskania czerwonobrązowego odcienia utrzymującego się przez minutę.

6. Obliczanie wyników

Ilość chlorku (X), wyrażonego jako udział procentowy chlorku sodu, oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

V1	=	objętość w ml dodanego roztworu azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l
V2	=	objętość w ml użytego do miareczkowania roztworu tiocyjanianu amonu o stężeniu 0,1 mol/l
m	=	masa w g próbki w podwielokrotnej części

Jeżeli próba ślepa wykaże, że roztwór azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l został zużyty, odjąć jego objętość od objętości (V1 - V2).

7. Objaśnienia

7.1.

Można także zastosować miareczkowanie potencjometryczne lub amperometryczne.

7.2.

W przypadku produktów bardzo bogatych w oleje i tłuszcze najpierw odtłuścić je eterem dietylowym lub eterem naftowym.

7.3.

W przypadku mączki rybnej miareczkowanie można prowadzić metodą Mohra.