ZAŁĄCZNIK

ENZYMATYCZNA METODA OZNACZANIA ZAWARTOŚCI SKROBI W PREPARATACH STOSOWANYCH DO KARMIENIA ZWIERZĄT PRZY UŻYCIU WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

1. Zakres

Niniejsza metoda opisuje enzymatyczne oznaczanie zawartości skrobi w paszy dla zwierząt. Zawartość skrobi oznacza się na podstawie ilościowego oznaczenia glukozy po enzymatycznym rozkładzie zawartej w próbce skrobi na glukozę. Przyjmuje się, że cała oznaczona ilość glukozy pochodzi ze skrobi zawartej w próbce.

2. Definicje

Metoda ta polega na oznaczeniu zawartości skrobi i produktów jej rozkładu o dużej masie cząsteczkowej, nierozpuszczalnych w 40 % etanolu. Zawartość skrobi jest wyrażona w % (m/m).

3. Zasada

Próbki homogenizuje się przez zmielenie. Próbkę przemywa się 40 % etanolem, aby usunąć cukry rozpuszczalne i rozpuszczalne produkty rozkładu skrobi.

Do zawiesiny dodaje się enzym - termostabilną alfa-amylazę. Enzym ten powoduje rozkład skrobi w temperaturze 100 °C na mniejsze łańcuchy, nawet jeśli skrobia nie jest całkowicie rozpuszczona. Większe grudki skrobi rozkładają się bardzo powoli. Dlatego też próbki powinny być dokładnie rozpuszczone lub mieć postać zawiesiny zawierającej bardzo małe cząstki stałe.

Następnie dodaje się drugi enzym, amyloglukozydazę, która powoduje hydrolizę zdegradowanych łańcuchów glukozowych do glukozy w temperaturze 60 °C.

Po odstaniu cieczy i oddzieleniu za pomocą filtracji obecnych w próbce białek, tłuszczów i pozostałości otrzymuje się klarowny roztwór, który może być użyty do analizy metodą HPLC.

Rozdział cukrów zawartych w próbce przeprowadza się za pomocą HPLC.

4. Odczynniki i inne materiały

Należy stosować odczynniki cz.d.a. oraz wodę demineralizowaną.

4. 1. Etanol, 40 % obj. roztwór wodny

4. 2. Glukoza, min. 99 %

4. 3. Roztwór amyloglukozydazy (1,4-alfa-D-glukanoglukohydrolaza) z Aspergillus niger (aktywność enzymu > 5 000 U/ml). Przechowywać w temperaturze około 4 °C.

Zamiennie można zastosować również amyloglukozydazę sproszkowaną.

4. 4. Termostabilna alfa-amylaza (1,4-alfa-D-glukano-glukanohydrolaza). Przechowywać w temperaturze około 4 °C.

4. 5. Octan cynku dihydrat, cz.d.a.

4. 6. Heksacyjanożelazian(II) potasu (K₄[Fe(CN)]₆.3H₂O), ekstra czysty

4. 7. Octan sodu bezwodny, cz.d.a.

4. 8. Kwas octowy lodowaty, 100 % (v/v)

4. 9. Octan sodu - bufor (0,2 mol/l)

Odważyć 16,4 g octanu sodu (pkt 4.7) i przenieść do zlewki. Rozpuścić w wodzie i przenieść do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml. Rozcieńczyć do kreski wodą i doprowadzić pH do 4,7 za pomocą kwasu octowego (wykorzystując pehametr (pkt 5.11). Roztwór ten nadaje się do użytku maksymalnie przez 6 miesięcy, przy czym należy go przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. 10. Roztwór amyloglukozydazy (aktywność enzymu > 250 U/ml)

Sporządzić roztwór z 5 ml roztworu amyloglukozydazy (pkt 4.3) lub 660 mg amyloglukozydazy sproszkowanej do objętości końcowej 100 ml przy użyciu octanu sodu - buforu (pkt 4.9). Sporządzać na bieżąco.

4. 11. Roztwór porównawczy

Sporządzić roztwory glukozy w wodzie w sposób stosowany w analizie metodą HPLC.

4. 12. Odczynnik do klarowania (Carrez I)

Rozpuścić 219,5 g octanu cynku (pkt 4.5) w wodzie, w zlewce. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml, dodać 30 ml kwasu octowego (pkt 4.8). Dokładnie wymieszać i dopełnić wodą. Roztwór ten nadaje się do użytku maksymalnie przez 6 miesięcy, przy czym należy go przechowywać w temperaturze otoczenia.

Można też stosować inne odczynniki klarujące równoważne płynowi Carreza.

4. 13. Odczynnik do klarowania (Carrez II)

Rozpuścić 106,0 g heksacyjanożelazianu(II) potasu (pkt 4.6) w wodzie, w zlewce. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml. Dokładnie wymieszać i dopełnić wodą. Roztwór ten nadaje się do użytku maksymalnie przez 6 miesięcy, przy czym należy go przechowywać w temperaturze otoczenia.

Można też stosować inne odczynniki klarujące równoważne płynowi Carreza.

4. 14. Faza ruchoma

Faza ruchoma jest przygotowywana w sposób stosowany w analizie cukrów metodą HPLC. W przypadku stosowania kolumny z żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami aminopropylowymi, fazą ruchomą jest na przykład mieszanina wody o czystości HPLC i acetonitrylu.

5. Aparatura

5. 1. Standardowe szkło laboratoryjne

5. 2. Wirówka o przyspieszeniu co najmniej 1 000 g (obliczonym dla środka probówki)

5. 3. Szklane probówki wirówkowe o pojemności 100 ml

5. 4. Mieszadło magnetyczne

5. 5. Magnetyczne elementy mieszające

5. 6. Sączki karbowane, np. 185 mm

5. 7. Filtry strzykawkowe, 0,45 um odpowiednie do roztworów wodnych

5. 8. Fiolki na próbki odpowiednie do aparatu do automatycznego pobierania próbek dla HPLC

5. 9. Kolby miarowe o pojemności 100 ml

5. 10. Strzykawki z tworzywa sztucznego, 5 i 10 ml

5. 11. Pehametr

5. 12. Łaźnia wodna z termostatem, zakres regulacji od 60 °C do 100 °C

5. 13. Płytki grzewcze z mieszadłami magnetycznymi

5. 14. Aparatura HPLC

5. 14.1. Pompa, przystosowana do pulsacji zerowej

5. 14.2. Aparat do automatycznego pobierania próbek

5. 14.3. Kolumna i kolumna wstępna odpowiednie do analizy cukrów

5. 14.4. Ogrzewacz kolumny, zakres temperatury - od temperatury otoczenia do 40 °C

5. 14.5. Detektor odpowiedni do analizy cukrów, np. refraktometr

5. 14.6. Układ całkujący

6. Procedura

6. 1. Informacje ogólne

Próbki analizowane są pojedynczo.

6. 2. Przygotowanie próbki dla kilku rodzajów produktów

Produkt homogenizuje się przez zmielenie.

6. 3. Wielkość próbki

Zawartość skrobi szacowana jest na podstawie deklaracji nt. składu surowcowego. Wielkość próbki (ważona z dokładnością do 0,1 mg) można oszacować ze wzoru:

6. 4. Próba ślepa

Próbę ślepą określa się wykonując pełną analizę (jak opisano w pkt 6.5) bez dodawania próbki. Wynik otrzymany dla próby ślepej wykorzystuje się przy obliczaniu zawartości skrobi (pkt 7.1).

6. 5. Analiza

6. 5.1. Przygotowanie próbek

Wymieszać próbkę za pomocą wstrząsania lub mieszania. Wybraną wielkość próbki (pkt 6.3) odważyć do probówki wirówkowej (pkt 5.3) i dodać 50 ml 40% etanolu (pkt 4.1). Zawartość mieszać, stosując mieszadło magnetyczne przez 20 minut w temperaturze otoczenia. Pozostawić element mieszający się w probówce i wirować przez pięć minut. Ostrożnie zasysać i usuwać fazę ciekłą (np. przy użyciu pipety Pasteura). Proces ekstrakcji powtarzać dodając dwa razy po 25 ml etanolu (pkt 4.1). Pozostałość przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 ml (pkt 5.9) przy użyciu około 70 ml wody.

Po rozpuszczeniu osadu lub uzyskaniu zawiesiny dodać 100 mikrolitrów termostabilnej alfa-amylazy (pkt 4.4) i ogrzewać w 100 °C przez 1 godzinę np. w łaźni wodnej (pkt 5.12). Ciecz schłodzić do 60 °C w łaźni wodnej i dodać 5 ml roztworu amyloglukozydazy (pkt 4.10). Kolbę umieścić na 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. Ciecz schłodzić do temperatury otoczenia i klarować próbkę przez dodanie 1 ml płynu Carreza I (pkt 4.12), wstrząsnąć i dodać następnie 1 ml płynu Carreza II (pkt 4.13). Płyny Carreza I i II mogą być dodane przed lub po schłodzeniu. Zawartość rozcieńczyć wodą do kreski, zhomogenizować, a roztwór przesączyć przez sączek karbowany (pkt 5.6). Zebrać ekstrakt próbki.

6. 5.2. Postępowanie z ekstraktami próbek

Ekstrakty przesączyć przez filtr strzykawkowy (pkt 5.7) za pomocą strzykawki (pkt 5.10), którą uprzednio przemyto ekstraktem. Przesącze zebrać do fiolek (pkt 5.8).

Uwaga: Filtr strzykawkowy można wykorzystywać kilkakrotnie. Należy go przemyć kolejnym ekstraktem, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez ekstrakt poprzedni.

6. 6. Chromatografia

Analizę metodą HPLC przeprowadza się konwencjonalnie dla analizy cukrów. Ponieważ próbki ekstrahuje się roztworem etanolu w wodzie, głównym cukrem podlegającym analizie jest glukoza. Jeśli analiza metodą HPLC wykaże ślady maltozy, może to oznaczać niecałkowity rozkład skrobi.

7. Obliczanie i przedstawianie wyników

7. 1. Obliczanie wyników analizy metodą HPLC

Zawartość glukozy (% m/m) oblicza się na podstawie wyników analizy metodą HPLC.

Roztwór enzymu amyloglukozydazy (pkt 4.3) jest stabilizowany glukozą. Ponadto termostabilna alfa-amylaza (pkt 4.4) stabilizowana sacharozą, która może zostać częściowo przekształcona w glukozę, w wyniku aktywności inwertazowej amyloglukozydazy. Dlatego też zmierzone stężenie glukozy (%, m/v) powinno być skorygowane o stężenie glukozy (%, m/v) w próbie ślepej. Zawartość glukozy (% m/m) skorygowaną względem próby ślepej, oblicza się następnie ze skorygowanego stężenia glukozy, masy próbki i kalibracji przy użyciu roztworów porównaczych (pkt 4.11).

7. 2. Obliczanie zawartości skrobi

Zawartość skrobi (% m/m) oblicza się z zawartości glukozy (% m/m) po uwzględnieniu poprawki na próbę ślepą.

Zawartość skrobi = 0,9 * glukoza skorygowana

8. Precyzja

8. 1. Test międzylaboratoryjny

Szczegóły dotyczące międzylaboratoryjnego testu odnośnie do precyzji tej metody podano w pkt 8.4.

8. 2. Powtarzalność

Bezwzględna różnica między dwoma niezależnymi pojedynczymi wynikami analiz otrzymanymi przy użyciu tej samej metody i materiału badawczego w tym samym laboratorium, przez tego samego laboranta na tym samym sprzęcie w zbliżonym czasie powinna być w nie więcej niż 5 % przypadków większa od granicy powtarzalności wynoszącej 1,1 % (m/m). Granica powtarzalności została wyznaczona w wyniku połączenia wyników testu międzylaboratoryjnego (zob. pkt 8.4).

8. 3. Odtwarzalność

Bezwzględna różnica między dwoma niezależnymi pojedynczymi wynikami analiz otrzymanymi przy użyciu tej samej metody i materiału badawczego w różnych laboratoriach, przez różnych laborantów na różnym sprzęcie powinna być w nie więcej niż 5 % przypadków większa od granicy odtwarzalności wynoszącej 3,7 % (m/m). Granica odtwarzalności została wyznaczona na podstawie połączonych wyników testu międzylaboratoryjnego (zob. pkt 8.4).

8. 4. Wyniki testu międzylaboratoryjnego

Test międzylaboratoryjny przeprowadzony został w latach 2005-2006 z udziałem europejskich laboratoriów celnych. Test przeprowadzono zgodnie z normą ISO 5725 oraz protokołem IUPAC (W. Horwitz, „Pure and Applied Chemistry”, tom 67, 1995, str. 331-343). Dane dotyczące precyzji zostały podane w poniższej tabeli.

Statystyczne wyniki badania międzylaboratoryjnego