KOMISJA EUROPEJSKA,

uwzględniając Traktat o funkcjonowaniu Unii Europejskiej,

uwzględniając rozporządzenie Komisji (WE) nr 1234/2007 z dnia 22 października 2007 r. ustanawiające wspólną organizację rynków rolnych oraz przepisy szczegółowe dotyczące niektórych produktów rolnych (rozporządzenie o jednolitej wspólnej organizacji rynku) (¹), w szczególności jego art. 113 ust. 1 lit. a) i art. 121 akapit pierwszy lit. a) i h), w związku z jego art. 4,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) W rozporządzeniu Komisji (EWG) nr 2568/91 (²) określono chemiczne i organoleptyczne właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek oraz ustalono metody oceny tych właściwości. Metody i wartości dopuszczalne stosowane w odniesieniu do oliwy należy uaktualnić na podstawie opinii ekspertów w dziedzinie chemii oraz zgodnie z wynikami prac prowadzonych w ramach Międzynarodowej Rady ds. Oliwy („IOC”).

(2) Aby zapewnić na poziomie Unii Europejskiej wdrażanie najnowszych norm międzynarodowych ustalonych przez IOC należy uaktualnić niektóre metody analizy, a także niektóre wartości dopuszczalne stosowane w odniesieniu do oliwy, określone w rozporządzeniu (EWG) nr 2568/91.

(3) W związku z tym należy dostosować wartości dopuszczalne stigmastadienów, wosków, kwasu mirystynowego i estrów alkilowych kwasów tłuszczowych i odpowiednio zmienić schematy podejmowania decyzji, w ramach których weryfikuje się, czy próbka oliwy z oliwek jest zgodna ze zgłoszoną kategorią. W celu ochrony konsumentów należy wprowadzić schematy podejmowania decyzji dotyczące kampesterolu i delta-7-stigmastenolu, którym towarzyszyć będą bardziej restrykcyjne parametry, w celu ułatwienia handlu i zagwarantowania autentyczności oliwy z oliwek. Należy zastąpić metodę analizy składu i zawartości steroli oraz oznaczania erytrodiolu i uwaolu metodą bardziej wiarygodną, która będzie obejmować także dialkohole triterpenowe. Należy również dokonać przeglądu oceny organoleptycznej oliwy z oliwek i wprowadzić metodę umożliwiającą wykrywanie obcych olejów roślinnych w oliwie z oliwek.

(4) W świetle rozwoju sytuacji w zakresie procedur dotyczących kontroli zgodności olejów należy odpowiednio dostosować metodę pobierania próbek oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek.

(5) Należy zatem odpowiednio zmienić rozporządzenie (EWG) nr 2568/91.

(6) Aby zapewnić czas na dostosowanie się do nowych przepisów i na wprowadzenie środków niezbędnych do ich stosowania oraz w celu uniknięcia zakłóceń podczas transakcji handlowych zmiany wprowadzone niniejszym rozporządzeniem należy stosować od dnia 1 marca 2014 r. Z tych samych powodów należy wprowadzić przepisy dotyczące oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek legalnie wyprodukowanej i oznakowanej w Unii Europejskiej lub legalnie przywiezionej do Unii Europejskiej oraz dopuszczonej do swobodnego obrotu przed tą datą w celu wprowadzenia jej do obrotu do momentu wyczerpania wszystkich zapasów.

(7) Środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodne z opinią Komitetu Zarządzającego ds. Wspólnej Organizacji Rynków Rolnych,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

Artykuł 1

W rozporządzeniu (EWG) nr 2568/91 wprowadza się następujące zmiany:

1) art. 2 otrzymuje brzmienie:

„ Artykuł 2

1. Właściwości olejów wymienione w załączniku I określa się zgodnie z następującymi metodami analizy:

a) metoda oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych wyrażonych jako procentowa część kwasu oleinowego, przedstawiona w załączniku II;

b) metoda oznaczania liczby nadtlenkowej, przedstawiona w załączniku III;

c) metoda oznaczania zawartości wosków, przedstawiona w załączniku IV;

d) metoda oznaczania składu i zawartości steroli i dialkoholi triterpenowych metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych, przedstawiona w załączniku V;

e) metoda oznaczania zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu, przedstawiona w załączniku VII;

f) metoda analizy spektrofotometrycznej, przedstawiona w załączniku IX;

g) metoda oznaczania składu kwasu tłuszczowego, przedstawiona w załączniku X A i X B;

h) metoda oznaczania lotnych rozpuszczalników chlorowcowanych, przedstawiona w załączniku XI;

i) metoda oceny właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, przedstawiona w załączniku XII;

j) metoda oznaczania stigmastadienów, przedstawiona w załączniku XVII;

k) metoda oznaczania zawartości triglicerydów z ECN42, przedstawiona w załączniku XVIII;

l) metoda oznaczania zawartości alkoholi alifatycznych, przedstawiona w załączniku XIX;

m) metoda oznaczania zawartości wosków, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych, przedstawiona w załączniku XX.

W celu wykrycia obecności obcych olejów roślinnych w oliwie z oliwek stosuje się metodę analizy przedstawioną w załączniku XXa.

2. Weryfikacja właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia prowadzona przez organy krajowe i ich przedstawicieli wykonywana jest przez zespoły degustatorów zatwierdzone przez państwa członkowskie.

Właściwości organoleptyczne oliwy, o których mowa w akapicie pierwszym, określa się jako zgodne ze zgłoszoną kategorią, jeżeli zespół degustatorów zatwierdzony przez państwo członkowskie potwierdzi taką klasyfikację.

W przypadku gdy zespół nie potwierdzi kategorii zgłoszonej w odniesieniu do właściwości organoleptycznych, na wniosek zainteresowanej strony organy krajowe lub ich przedstawiciele zapewniają niezwłoczne przeprowadzenie przez inne zatwierdzone zespoły dwóch ocen porównawczych, z których przynajmniej jedna wykonana jest przez zainteresowane państwo członkowskie będące producentem. Przedmiotowe właściwości określa się jako zgodne ze zgłoszonymi właściwościami, jeżeli co najmniej dwie z ocen porównawczych potwierdzą zgłoszoną klasyfikację. Jeżeli tak się nie stanie, zainteresowana strona ponosi koszty ocen porównawczych.

3. W przypadku gdy organy krajowe lub ich przedstawiciele sprawdzają właściwości oliwy, jak przewidziano w ust. 1, próbki pobiera się zgodnie z normami międzynarodowymi: normą EN ISO 661 dotyczącą przygotowania próbek do badań oraz normą EN ISO 5555 dotyczącą pobierania próbek. Jednak niezależnie od przepisów pkt 6.8 normy EN ISO 5555, w przypadku partii takiej oliwy w opakowaniu bezpośrednim próbkę pobiera się zgodnie z załącznikiem Ia do niniejszego rozporządzenia. W przypadku oliwy luzem, której próbek nie można pobrać zgodnie z normą EN ISO 5555, pobieranie próbek wykonuje się zgodnie z instrukcjami opracowanymi przez właściwy organ państwa członkowskiego.

Bez uszczerbku dla normy EN ISO 5555 oraz rozdziału 6 normy EN ISO 661 pobrane próbki jak najszybciej umieszcza się w ciemnym miejscu, z dala od źródeł wysokiej temperatury i wysyła się do laboratorium w celu poddania analizie nie później niż piątego dnia roboczego po ich pobraniu, w przeciwnym razie próbki przechowuje się w taki sposób, aby nie uległy rozpadowi ani uszkodzeniu w czasie transportu lub przechowywania, zanim zostaną wysłane do laboratorium.

4. Do celów weryfikacji przewidzianej w ust. 3, analizy, o których mowa w załącznikach II, III, IX i XX, oraz w stosownych przypadkach wszystkie analizy porównawcze wymagane na mocy prawa krajowego, wykonuje się przed upływem daty minimalnej trwałości w przypadku produktów pakowanych. W przypadku pobierania próbek oliwy luzem analizy te wykonuje się nie później niż po upływie sześciu miesięcy od miesiąca, w którym pobrano próbkę.

Nie stosuje się żadnych terminów w przypadku innych analiz przewidzianych w niniejszym rozporządzeniu.

Jeżeli wyniki analiz nie odpowiadają właściwościom zgłoszonej kategorii oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek, zainteresowana strona powiadamiana jest nie później niż miesiąc przed końcem okresu określonego w akapicie pierwszym, chyba że próbkę pobrano później niż dwa miesiące przed upływem daty minimalnej trwałości.

5. W celu oznaczenia właściwości różnych rodzajów oliwy z oliwek za pomocą metod przewidzianych w ust. 1 akapit pierwszy wyniki analiz porównuje się bezpośrednio z limitami określonymi w niniejszym rozporządzeniu.” ;

2) załącznik I zastępuje się tekstem określonym w załączniku I do niniejszego rozporządzenia;

3) załącznik Ia zastępuje się tekstem określonym w załączniku II do niniejszego rozporządzenia;

4) załącznik Ib zastępuje się tekstem określonym w załączniku III do niniejszego rozporządzenia;

5) załącznik V zastępuje się tekstem określonym w załączniku IV do niniejszego rozporządzenia;

6) skreśla się załącznik VI;

7) załącznik XII zastępuje się tekstem określonym w załączniku V do niniejszego rozporządzenia;

8) załącznik XXa, którego tekst określony jest w załączniku VI do niniejszego rozporządzenia, dodaje się po załączniku XX.

Artykuł 2

Produkty legalnie wyprodukowane i oznaczone w Unii Europejskiej lub legalnie przywiezione do Unii Europejskiej i dopuszczone do swobodnego obrotu przed dniem 1 marca 2014 r. mogą być wprowadzane do obrotu do momentu wyczerpania wszystkich zapasów.

Artykuł 3

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie siódmego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie stosuje się od dnia 1 marca 2014 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.

Sporządzono w Brukseli dnia 16 grudnia 2013 r.

ZAŁĄCZNIK I

Zmiana załącznika I

„ZAŁĄCZNIK 1

WŁAŚCIWOŚCI OLIWY Z OLIWEK

Uwagi:

a) wyniki analiz muszą być wyrażone z dokładnością do tej samej liczby miejsc po przecinku, jaką zastosowano w odniesieniu do każdej właściwości. Ostatnia cyfra musi być powiększona o jeden, jeżeli następna cyfra jest większa niż 4;

b) jeżeli tylko jedna właściwość nie jest zgodna z wskazanymi wartościami, kategoria oliwy może zostać zmieniona lub zgłoszona jako niezgodna pod względem czystości do celów niniejszego rozporządzenia;

c) jeżeli właściwość oznaczona jest gwiazdką (*), w odniesieniu do jakości oliwy oznacza to, że: – w przypadku oliwy z oliwek typu lampante obie odpowiednie wartości dopuszczalne mogą jednocześnie różnić się od podanych; w przypadku oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, jeżeli co najmniej jedna z wartości dopuszczalnych różni się od podanych wartości, kategoria oliwy zostanie zmieniona, jedna i druga będzie nadal zaliczana do jednej z kategorii oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.

d) jeżeli właściwość oznaczona jest dwiema gwiazdkami (**), oznacza to, że w przypadku wszystkich rodzajów oliwy z wytłoczyn oliwek obie odpowiednie wartości dopuszczalne mogą różnić się jednocześnie od podanych wartości.

Dodatek

Schemat podejmowania decyzji

Schemat podejmowania decyzji dotyczących kampesterolu w przypadku oliwy z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia i oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia

Pozostałe parametry są zgodne z wartościami dopuszczalnymi określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

Schemat podejmowania decyzji dotyczących delta-7-stigmastenolu w przypadku:

– Oliwa z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia i oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia

Pozostałe parametry są zgodne z wartościami dopuszczalnymi określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

– Oliwa z wytłoczyn z oliwek (surowa i rafinowana)

ZAŁĄCZNIK II

Zmiana załącznika Ia

„ZAŁĄCZNIK Ia

POBIERANIE PRÓBEK OLIWY Z OLIWEK LUB OLIWY Z WYTŁOCZYN Z OLIWEK DOSTARCZONYCH W OPAKOWANIU BEZPOŚREDNIM

Ta metoda pobierania próbek ma zastosowanie do partii oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek umieszczonych w opakowaniu bezpośrednim. W zależności od tego, czy zawartość opakowania bezpośredniego przekracza 5 litrów czy też nie, zastosowanie mają różne metody pobierania próbek.

„Partia” oznacza zbiór opakowań detalicznych, które są produkowane, wytwarzane i pakowane w takich warunkach, w których oliwę zawartą w każdym opakowaniu detalicznym uważa się za jednorodną pod względem wszystkich właściwości analitycznych. Oznakowanie partii musi zostać przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2011/91/UE (¹).

„ Próbka jednostkowa” oznacza ilość oliwy zawartej w opakowaniu bezpośrednim, pobraną z dowolnego miejsca partii.

1. ZAWARTOŚĆ PRÓBKI PIERWOTNEJ

1.1. Opakowanie bezpośrednie nieprzekraczające 5 litrów

„Próbka pierwotna” w przypadku opakowania bezpośredniego nieprzekraczającego 5 litrów oznacza liczbę próbek jednostkowych pobranych w danej partii zgodnie z tabelą 1.

Tabela 1

Minimalna próbka pierwotna powinna zawierać

Liczba opakowań wymienionych w tabeli 1, które tworzą próbkę pierwotną, może być zwiększona przez każde państwo członkowskie, zgodnie z jego własnymi potrzebami (na przykład ocena organoleptyczna dokonana przez laboratorium inne niż to, które wykonało analizy chemiczne, analizy porównawcze itd.).

1.2. Opakowanie bezpośrednie przekraczające 5 litrów

„Próbka pierwotna” w przypadku opakowań bezpośrednich przekraczających 5 litrów oznacza reprezentatywną część łącznych próbek jednostkowych, otrzymaną w procesie redukcyjnym zgodnie z tabelą 2. W skład próbki pierwotnej muszą wchodzić różne przykłady.

„Przykład” próbki pierwotnej oznacza każde opakowanie wchodzące w skład próbki pierwotnej.

Tabela 2

Minimalna liczba próbek jednostkowych, które należy pobrać

W celu ograniczenia objętości próbkowanych opakowań bezpośrednich zawartość pobieranych próbek jednostkowych jest homogenizowana w celu przygotowania próbki pierwotnej. Części różnych próbek jednostkowych wlewane są do wspólnego pojemnika w celu poddania ich homogenizacji przez wymieszanie, aby jak najlepiej zabezpieczyć je przed dostępem powietrza.

Próbkę pierwotną należy wlać do kilku opakowań o minimalnej pojemności wynoszącej 1,0 litr, z których każde stanowi przykład próbki pierwotnej.

Liczba próbek pierwotnych może być zwiększana przez każde państwo członkowskie, zgodnie z jego własnymi potrzebami (na przykład ocena organoleptyczna dokonana przez laboratorium inne niż to, które wykonało analizy chemiczne, analizy kontrolne itd.).

Każde opakowanie należy napełnić w taki sposób, aby warstwa powietrza nad próbką była jak najmniejsza, a następnie odpowiednio zamknąć w celu zabezpieczenia produktu.

Przykłady te należy oznakować w celu zapewnienia prawidłowej identyfikacji.

2. ANALIZY I WYNIKI

2.1. Każdą próbkę pierwotną należy podzielić na próbki laboratoryjne, zgodnie z pkt 2.5 normy EN ISO 5555, i analizować w kolejności przedstawionej na schemacie podejmowania decyzji opisanym w załączniku Ib lub w innej dowolnej kolejności.

2.2. Jeżeli wszystkie wyniki analiz są zgodne z właściwościami zgłoszonej kategorii oliwy, cała partia ma być zgłoszona jako zgodna.

Jeżeli jeden wynik analizy nie jest zgodny z właściwościami zgłoszonej kategorii oliwy, cała partia zostaje zgłoszona jako niezgodna.

3. WERYFIKACJA KATEGORII DANEJ PARTII

3.1. W celu zweryfikowania kategorii danej partii właściwy organ może zwiększyć liczbę próbek pierwotnych pobranych w różnych punktach partii zgodnie z następującą tabelą:

Tabela 3

Liczba próbek pierwotnych uwarunkowana wielkością partii

Każda próbka jednostkowa stanowiąca próbkę pierwotną musi zostać pobrana z ciągłej części partii; konieczne jest zapisanie miejsca pobrania każdej próbki pierwotnej i jej jednoznaczne zidentyfikowanie.

Tworzenie każdej próbki pierwotnej musi przebiegać zgodnie z procedurami, o których mowa w pkt 1.1 oraz 1.2.

Każdą próbkę pierwotną poddaje się następnie analizom, o których mowa w art. 2 ust. 1.

3.2. Jeżeli jeden z wyników analiz, o których mowa w art. 2 ust. 1, co najmniej jednej próbki pierwotnej jest niezgodny z właściwościami zgłoszonej kategorii oliwy, cała partia pobieranych próbek zostaje zgłoszona jako niezgodna.”.

(¹) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2011/91/UE w sprawie oznaczeń lub oznakowań identyfikacyjnych partii towaru, do której należy dany środek spożywczy (Dz.U. L 334 z 16.11.2011, s. 1).

ZAŁĄCZNIK III

Zmiana załącznika Ib

„ZAŁĄCZNIK Ib

SCHEMAT PODEJMOWANIA DECYZJI, CZY PRÓBKA OLIWY Z OLIWEK JEST ZGODNA ZE ZGŁOSZONĄKATEGORIĄ

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3

Dodatek 1

Tabela równoważności między załącznikami do niniejszego rozporządzenia a analizami określonymi w schemacie podejmowania decyzji

ZAŁĄCZNIK IV

Zmiana załącznika V

„ZAŁĄCZNIK V

OZNACZENIA SKŁADU I ZAWARTOŚCI STEROLI I DIALKOHOLI TRITERPENOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH

1. ZAKRES

W ramach metody opisuje się sposoby oznaczania zawartości prostych i łącznych steroli oraz dialkoholi triterpenowych w oliwie z oliwek i oliwie z wytłoczyn z oliwek.

2. ZASADA

Oliwa, do której dodano α-cholestanol, pełniąca rolę wewnętrznego wzorca, jest zmydlana roztworem wodorotlenku potasu w etanolu, a następnie substancja niezmydlająca się jest ekstrahowana eterem dietylowym.

Frakcje steroli i frakcja dialkoholi triterpenowych są oddzielane od substancji niezmydlającej się metodą chromatografii cienkowarstwowej na podstawowej płytce z żelu krzemionkowego. Frakcje uzyskane z żelu krzemionkowego przekształcane są w trimetylsilyletery i następnie poddawane analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

3. APARATURA

Typowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności następujące urządzenia:

3.1. Kolba o pojemności 250 ml wyposażona w chłodnicę zwrotną ze szlifem szklanym.

3.2. Rozdzielacz o pojemności 500 ml.

3.3. Kolby o pojemności 250 ml.

3.4. Kompletny zestaw aparatury do analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej łącznie z płytkami szklanymi 20 × 20.

3.5. Źródło światła ultrafioletowego o długości fal 254 lub 366 nm.

3.6. Mikrostrzykawki o pojemności 100 i 500 μ l.

3.7. Cylindryczny lejek do sączenia z porowatą przegrodą G3 (porowatość 15–40 μm) o średnicy około 2 cm i głębokości 5 cm, przystosowany do filtracji w próżni i ze szlifem szklanym zewnętrznym.

3.8. Kolba stożkowa próżniowa o pojemności 50 ml ze szlifem szklanym wewnętrznym, którą można połączyć z lejkiem do sączenia (pkt 3.7).

3.9. Probówka o pojemności 10 ml z lejkowatym dnem i szczelnym korkiem szklanym.

3.10. Chromatograf gazowy współpracujący z kolumną kapilarną z systemem rozdziału strumienia, składający się z:

3.10.1. komory termostatycznej do kolumn w celu utrzymania wymaganej temperatury z dokładnością do +/– 1 °C;

3.10.2. regulowanego termostatem zespołu dozowania z otworem wytryskowym ze szkła krzemowanego i z systemem rozdziału strumienia;

3.10.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID);

3.10.4. systemu gromadzenia danych współpracującego z detektorem FID (pkt 3.10.3.), z możliwością całkowania ręcznego.

3.11. Kolumna kapilarna wypełniona żelem krzemionkowym o długości 20–30 m, o wewnętrznej średnicy 0,25– 0,32 mm, pokryta w 5 % difenylem i w 95 % dimetylopolisiloksanem (faza stacjonarna SE-52 lub SE-54 lub podobna), o jednakowej grubości wynoszącej 0,10–0,30 μm.

3.12. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μ l przeznaczona do chromatografii gazowej z umocowaną na stałe igłą do rozdzielania strumienia.

3.13. Eksykator z chlorkiem wapnia.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Minimalne miano roztworu wodorotlenku potasu 85 %.

4.2. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 2 mol/l.

Rozpuścić 130 g wodorotlenku potasu (pkt 4.1), jednocześnie schładzając, w 200 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (pkt 4.10). Roztwór przechowywać w dobrze zakorkowanej butelce z ciemnego szkła przez maksymalnie dwa dni.

4.3. Eter dietylowy do analiz.

4.4. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 0,2 mol/l.

Rozpuścić 13 g wodorotlenku potasu (pkt 4.1) w 20 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (pkt 4.10).

4.5. Bezwodny siarczan sodu do analiz.

4.6. Płytki szklane (20 × 20 cm) pokryte żelem krzemionkowym nie zawierającym wskaźnika fluorescencyjnego o grubości 0,25 mm (dostępne w handlu w postaci gotowej do użytku).

4.7. Toluilen do chromatografii.

4.8. Aceton do chromatografii.

4.9. n-heksan do chromatografii.

4.10. Eter dietylowy do chromatografii.

4.11. Etanol do analiz.

4.12. Octan etylu do analiz.

4.13. Roztwór porównawczy stosowany w chromatografii cienkowarstwowej: roztwór cholesterolu lub fitosterolu i erytrodiolu w octanie etylu o stężeniu 5 % (pkt 4.11).

4.14. 0,2 % roztwór 2,7-dichlorofluorosceiny w etanolu. Roztwór ten uzyskuje nieco zasadowy charakter w wyniku dodania kilku kropli 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w alkoholu (pkt 4.2).

4.15. Bezwodnik pirydyny do chromatografii (zob. uwaga 5).

4.16. Heksametyldizylazyna do analiz.

4.17. Trimetylchlorosilan do analiz.

4.18. Roztwory próbek eterów trimetylosilanowych steroli.

Należy je przygotować tuż przed użyciem ze steroli i erytrodiolu uzyskanych z zawierających je olejów.

4.19. α -cholestanol o czystości większej niż 99 % (czystość należy sprawdzać metodą analizy GC).

4.20. 0,2 % wewnętrzny roztwór wzorcowy (m/V) α -cholestanolu w octanie etylu (pkt 4.11).

4.21. Roztwór fenoloftaleiny, 10 g/l w etanolu (pkt 4.10).

4.22. Gaz nośny: czysty wodór lub hel do celów chromatografii gazowej.

4.23. Gazy pomocnicze: Czysty wodór, hel, azot i powietrze do celów chromatografii gazowej.

4.24. Mieszanina n-heksanu (pkt 4.9)/eteru dietylowego (pkt 4.10) w proporcji 65:35 (V/V).

4.25. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania składający się z mieszaniny pirydyny/heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu w proporcji 9:3:1 (V/V/V).

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie substancji niezmydlającej się.

5.1.1. Do kolby o pojemności 250 ml (pkt 3.1) wprowadzić przy użyciu mikrostrzykawki o pojemności 500 μl (pkt 3.6) pewną ilość wewnętrznego roztworu wzorcowego α-cholestanolu (pkt 4.20) zawierającą ilość cholestanolu odpowiadającą w przybliżeniu 10 % steroli w próbce. Na przykład w przypadku próbki zawierającej 5 g oliwy z oliwek dodać 500 μl roztworu α -cholestanolu (pkt 4.20), a w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek 1 500 μl. Odparować do wysuszenia pod słabym strumieniem azotu w łaźni wypełnionej ciepłą wodą, następnie po schłodzeniu kolby odważyć 5 +/– 0,01 g suchej przefiltrowanej próbki w tej samej kolbie.

Uwaga 1: w przypadku zwierzęcych lub roślinnych olejów i tłuszczów zawierających znaczne ilości cholesterolu może wystąpić pik o czasie retencji zbliżonym do cholestanolu. W takich sytuacjach należy dokonać analizy frakcji steroli z dodaniem wewnętrznego wzorca i bez dodawania go.

5.1.2. Dodać 50 ml 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w etanolu (pkt 4.2) i niewielką ilość kamienia pumeksowego, uruchomić chłodnicę zwrotną i podgrzać do momentu lekkiego wrzenia aż nastąpi zmydlenie (roztwór stanie się przejrzysty). Kontynuować podgrzewanie przez dalsze 20 minut, następnie wprowadzić 50 ml wody destylowanej od strony wylotu chłodnicy, odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury około 30 °C.

5.1.3. Przenieść zawartość kolby ilościowo do rozdzielacza o pojemności 500 ml (pkt 3.2), używając kilku porcji wody destylowanej (50 ml). Dodać około 80 ml eteru dietylowego (pkt 4.10), mieszać energicznie przez około 60 sekund, obniżając okresowo ciśnienie przez przełączenie rozdzielacza i otwarcie zaworu odcinającego. Odstawić do całkowitego rozdzielenia się dwóch faz (uwaga 2).

Następnie do drugiego rozdzielacza zebrać jak najdokładniej roztwór mydła. Przeprowadzić jeszcze dwie ekstrakcje na fazie wodno-alkoholowej w ten sam sposób przy użyciu 60–70 ml eteru dietylowego (pkt 4.10).

Uwaga 2: emulsję można wyeliminować, dodając niewielkie ilości etanolu (pkt 4.11).

5.1.4. Połączyć wszystkie trzy eterowe ekstrakty w jednym rozdzielaczu zawierającym 50 ml wody. Przemywać nadal wodą (50 ml), aż woda przestanie barwić się na różowy kolor po dodaniu kropli roztworu fenoloftaleiny (pkt 4.21).

Po usunięciu wody popłucznej przefiltrować przez bezwodny siarczan sodu (pkt 4.5) do wcześniej zważonej kolby o pojemności 250 ml, płucząc rozdzielacz i filtr niewielkimi ilościami eteru dietylowego (pkt 4.10).

5.1.5. Odparować rozpuszczalnik przez destylację przy użyciu wyparki obrotowej w temperaturze 30 °C w próżni. Dodać 5 ml acetonu i usunąć całkowicie lotny rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem powietrza. Suszyć pozostałość w piecu w temperaturze 103 +/– 2 ° C przez 15 minut. Schłodzić w eksykatorze i zważyć z dokładnością do 0,1 mg.

5.2. Oddzielenie frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych (erytrodiol + uwaol)

5.2.1. Przygotowanie podstawowych płytek do chromatografii cienkowarstwowej Zanurzyć płytki z żelu krzemionkowego (pkt 4.6) na głębokość około 4 cm w 0,2 mol/l roztworze wodorotlenku potasu w etanolu (pkt 4.5) na 10 sekund, następnie suszyć je w dygestorium przez dwie godziny i na koniec umieścić w piecu nagrzanym do temperatury 100 °C na godzinę.

Wyjąć z pieca i umieścić w eksykatorze z chlorkiem wapnia (pkt 3.13) aż do czasu ich użycia (płytki poddane takiej obróbce powinny być wykorzystane w ciągu 15 dni).

Uwaga 3: w przypadku stosowania podstawowych płytek z żelu krzemionkowego do oddzielania frakcji steroli nie ma potrzeby poddawania frakcji niezmydlającej się działaniu tlenku glinu. W ten sposób wszystkie związki o charakterze kwasowym (kwasy tłuszczowe i inne) zatrzymują się na linii początkowej, a pasmo steroli jest wyraźnie oddzielone od pasma alkoholi alifatycznych i triterpenowych.

5.2.2. Napełnić komorę chromatograficzną mieszaniną heksanu i eteru dietylowego (pkt 4.24) (uwaga 4) do poziomu około 1 cm. Zamknąć komorę odpowiednią pokrywą i pozostawić na co najmniej godzinę w chłodnym miejscu w celu uzyskania równowagi układu ciecz-para; na wewnętrznych powierzchniach komory można umieścić paski bibuły filtracyjnej zanurzone w eluencie. Pozwala to skrócić o około jedną trzecią czas przemieszczenia linii cieczy i uzyskać bardziej jednorodną i regularną elucję składników.

Uwaga 4: przy każdej analizie należy wymienić mieszaninę rozwijającą w celu uzyskania idealnie odtwarzalnych warunków elucji, zamiennie można stosować rozpuszczalnik w postaci mieszaniny n-heksanu i eteru dietylowego w proporcji 50:50 (V/V).

5.2.3. Przygotować roztwór substancji niezmydlającej się (pkt 5.1.5) w octanie etylu (pkt 4.12) o stężeniu około 5 % i za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 100 μl nanieść 0,3 ml roztworu w postaci wąskiego i jednolitego pasma na dolnej części płytki chromatograficznej (pkt 5.2.1) w odległości 2 cm od dolnej krawędzi. Na linii pasma nanieść 2–3 μl roztworu porównawczego (pkt 4.13) w celu identyfikacji pasma steroli i dialkoholi triterpenowych po rozwinięciu.

5.2.4. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej przygotowanej w sposób opisany w pkt 5.2.2. Temperaturę otoczenia należy utrzymywać w granicach 15– 20 °C (uwaga 5). Bezzwłocznie zakryć komorę pokrywą i pozostawić w celu elucji składników aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość około 1 cm od górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę z komory chromatograficznej i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza lub umieścić w tym celu płytkę na chwilę w dygestorium.

Uwaga 5: wyższa temperatura mogłaby utrudniać oddzielenie.

5.2.5. Spryskać płytkę lekko i równomiernie roztworem 2,7-dichlorofluorosceiny (pkt 4.14) i pozostawić do wyschnięcia. Obserwując płytkę w świetle ultrafioletowym, pasma steroli i dialkoholi triterpenowych można zidentyfikować, przyrównując je do plamek uzyskanych za pomocą roztworu porównawczego (pkt 4.13). Zaznaczyć czarnym ołówkiem granice pasm wzdłuż krawędzi fluoryzujących (zob. wykres 3 dotyczący płytki TLC).

5.2.6. Za pomocą metalowej szpatułki zeskrobać żel krzemionkowy z zaznaczonego obszaru. Usunięty i dokładnie rozdrobniony materiał przenieść do lejka do sączenia (pkt 3.7). Dodać 10 ml gorącego octanu etylu (pkt 4.12), ostrożnie wymieszać za pomocą metalowej szpatułki i przefiltrować w próżni, zbierając filtrat do kolby stożkowej (pkt 3.8) połączonej z lejkiem do sączenia.

Pozostałość na filtrze przepłukać trzykrotnie eterem dietylowym (pkt 4.3) (około 10 ml przy każdym płukaniu), zbierając filtrat do tej samej kolby połączonej z lejkiem, odparować filtrat do objętości 4–5 ml, przelać pozostały roztwór do zważonej wcześniej probówki o pojemności 10 ml (pkt 3.9), wysuszyć poprzez lekkie podgrzewanie w delikatnym strumieniu azotu, rozpuścić jeszcze raz kilkoma kroplami acetonu (pkt 4.8), ponownie wysuszyć.

Pozostałość znajdująca się w probówce to frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych.

5.3. Przygotowanie trimetylsilyloeterów

5.3.1. Do probówki zawierającej frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych dodać odczynnik wywołujący reakcję sililowania (pkt 4.25) (uwaga 6) w ilości 50 μl na każdy miligram steroli i dialkoholi triterpenowych, w sposób pozwalający uniknąć wchłaniania wilgoci (uwaga 7).

Uwaga 6: w handlu dostępne są gotowe roztwory. Inne odczynniki sililujące, takie jak na przykład bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylochlorosilanu, który musi zostać wymieszany z taką samą ilością bezwodnika pirydyny, również są dostępne.

Pirydynę można zastąpić taką samą ilością acetonitrylu.

5.3.2. Zamknąć probówkę korkiem i ostrożnie wstrząsać (bez odwracania) aż do całkowitego rozpuszczenia się związków. Pozostawić na co najmniej 15 minut w temperaturze otoczenia, a następnie wirować przez kilka minut. Przejrzysty roztwór można poddać analizie metodą chromatografii gazowej.

Uwaga 7: pojawienie się lekkiej opalizacji jest zjawiskiem normalnym i nie stanowi żadnej nieprawidłowości. Pojawienie się białej zawiesiny lub różowego koloru wskazuje na obecność wilgoci w odczynniku lub pogorszenie jego jakości. W takich przypadkach badanie należy powtórzyć (tylko w przypadku zastosowania heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu).

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej

5.4.1. Czynności wstępne, przygotowanie kolumn kapilarnych

5.4.1.1. Osadzić kolumnę (pkt 3.11) w chromatografie gazowym, podłączając końcówkę wlotową do dozownika z rozdziałem strumienia, a końcówkę wylotową do detektora.

Dokonać ogólnych kontroli zespołu chromatografu gazowego (szczelność układu zasilania gazem, wydajność detektora, wydajność systemu dzielenia strumienia i systemu zapisu itd.)

5.4.1.2. Jeżeli kolumna zostaje użyta po raz pierwszy, zaleca się jej przygotowanie: przepuścić powoli przez kolumnę strumień gazu, następnie włączyć zespół chromatografu gazowego i rozpocząć stopniowe podgrzewanie do temperatury co najmniej 20 °C powyżej temperatury roboczej (uwaga 8). Utrzymywać taką temperaturę przez co najmniej dwie godziny, następnie ustawić zespół w trybie pracy (regulacja strumienia gazu i układu rozdzielania, zapalenie płomienia, połączenie z systemem obliczeniowymi, regulacja temperatury kolumny, detektora i dozownika itd.), a następnie rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwa razy większą niż przewidziana czułość analizy. Przebieg linii podstawowej musi mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików i bez przesunięcia.

Ujemne przesunięcie prostej linii wskazuje na nieszczelność połączeń kolumn; przesunięcie dodatnie wskazuje na niedostateczne przygotowanie kolumny.

Uwaga 8: temperatura przygotowania kolumn musi zawsze być co najmniej o 20 °C niższa niż maksymalna temperatura określona dla fazy stacjonarnej.

5.4.2. Dobór warunków roboczych

5.4.2.1. Warunki robocze są następujące:

– temperatura kolumny: 260 +/– 5 °C;

– temperatura dozownika: 280–300 °C;

– temperatura detektora: 280–300 °C;

– prędkość liniowa gazu nośnego: hel 20–35 cm/s; wodór 30–50 cm/s;

– stosunek rozdziału strumienia: 1:50–1:100;

– czułość przyrządów: 4– 16 razy minimalne tłumienie;

– czułość rejestratora: 1–2 mV w pełnej skali;

– ilość wprowadzonej substancji: 0,5–1 μl roztworu TMSE.

Warunki te mogą być zmieniane zgodnie z charakterystyką kolumny i chromatografu gazowego w celu uzyskiwania chromatogramów spełniających następujące wymogi:

– czas retencji w przypadku piku ß-sitosterolu powinien wynosić 20 +/– 5 min;

– pik kampesterolu powinien wynosić: w przypadku oliwy z oliwek (średnia zawartość 3 %) 20 +/– 5 % w pełnej skali; w przypadku oleju sojowego (średnia zawartość 20 %) 80 +/– 10 % w pełnej skali;

– Należy oddzielić wszystkie występujące sterole. Oprócz całkowitego oddzielenia od siebie piki muszą także całkowicie rozdzielone, co oznacza, że wykres piku musi łączyć się z linią podstawową, zanim przejdzie w następny pik. Niepełna rozdzielczość jest jednak tolerowana, pod warunkiem że pik w punkcie RRT 1,02 (sitostanol) może zostać oznaczony ilościowo na podstawie linii prostopadłej.

5.4.3. Procedura analityczna

5.4.3.1. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl pobrać 1 μl heksanu, zassać 0,5 μl powietrza i następnie 0,5–1 μl roztworu próbki. Pociągnąć dalej tłoczek w celu opróżnienia igły. Wprowadzić igłę przez membranę dozownika i po jednej, dwóch sekundach szybko wstrzyknąć, a następnie powoli wyjąć igłę po około pięciu sekundach.

Można zastosować także dozownik automatyczny.

5.4.3.2. Prowadzić rejestrację do całkowitego wyeluowania TMSE obecnych w próbce dialkoholi triterpenowych. Linia podstawowa powinna nadal spełniać wymogi (pkt 5.4.1.2).

5.4.4. Identyfikacja pików

Zidentyfikować poszczególne piki na podstawie czasów retencji oraz przez porównanie z mieszaniną steroli i TMSE dialkoholi triterpenowych poddanych analizie w takich samych warunkach (zob. dodatek).

Sterole i dialkohole triterpenowe podlegają elucji w następującej kolejności: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-awenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-awenasterol, erytrodiol i uwaol.

Czasy retencji ß-sitosterolu na kolumnach SE-52 i SE-54 przedstawione są w tabeli 1.

Na rysunkach 1 i 2 przedstawione są typowe chromatogramy niektórych rodzajów oliwy.

5.4.5. Ocena ilościowa

5.4.5.1. Obliczyć powierzchnie pików α-cholestanolu i steroli oraz dialkoholi triterpenowych za pomocą systemu obliczeniowego. Pominąć związki, które nie są ujęte w tabeli 1 (nie należy uwzględniać w obliczeniach ergosterolu). Współczynnik odpowiedzi w przypadku α-cholestanolu przyjmuje się jako równy 1.

5.4.5.2. Obliczyć stężenie każdego poszczególnego sterolu w mg/kg substancji tłuszczowej w następujący sposób:

gdzie:

A_x = powierzchnia piku w przypadku sterola x, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym

A_s = powierzchnia piku α-cholestanolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym

m_s = masa dodanego α-cholestanolu, w miligramach

m = masa próbki użytej do oznaczenia, w gramach

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

6.1. Podać stężenie poszczególnego sterolu w mg/kg substancji tłuszczowej i ich sumę jako „sterole całkowite”.

Skład każdego z poszczególnych steroli oraz skład erytrodiolu i uwaolu należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Zawartość całkowitych steroli musi być podana jako liczba całkowita bez przecinka dziesiętnego.

6.2. Procentową zawartość każdego poszczególnego sterolu obliczyć na podstawie stosunku powierzchni odpowiedniego piku do sumy powierzchni pików steroli, erytrodiolu i uwaolu:

gdzie:

A_x = powierzchnia piku dla x;

ΣA = suma powierzchni pików dla steroli;

6.3. APP β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-awenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Obliczyć procentową zawartość erytrodiolu i uwaolu:

gdzie:

ΣA = suma powierzchni piku dla steroli, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym;

Er = powierzchnia erytrodiolu zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym;

Uv = powierzchnia uwaolu zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.

Dodatek

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki pracy wstrzyknąć 1–3 μl metanu (lub propanu) i zmierzyć czas, w jakim gaz przejdzie przez kolumnę od momentu wstrzyknięcia do momentu, w którym pojawi się pik (tM).

Prędkość liniowa w cm/s jest określona jako L/tM, gdzie L oznacza długość kolumny w centymetrach, a tM oznacza czas zmierzony w sekundach.

Tabela 1

Względne czasy retencji dla steroli

Rysunek 1

Chromatogram gazowy frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych oliwy z oliwek typu lampante (wzmocniony wewnętrznym wzorcem)

Rysunek 2

Chromatogram gazowy frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych rafinowanej oliwy z oliwek (wzmocniony wewnętrznym wzorcem)

Rysunek 3

Płytka TLC oliwy z wytłoczyn z oliwek ze strefą, którą musi zostać zeskrobana w celu oznaczenia steroli i dialkoholi triterpenowych

1 – skwalen

2 – alkohole triterpenowe i alifatyczne

3 – sterole i dialkohole triterpenowe

4 – początkowe i wolne kwasy tłuszczowe.”

ZAŁĄCZNIK VI

Zmiana załącznika XXa

„ZAŁĄCZNIK XXa

METODA WYKRYWANIA OLEJÓW OBCYCH W OLIWIE Z OLIWEK

1. ZAKRES

Metoda ta znajduje zastosowanie w wykrywaniu obecności obcych olejów roślinnych w oliwie z oliwek. W oliwie z oliwek mogą być wykryte oleje roślinne z wysoką zawartością kwasu linolowego (sojowe, rzepakowe, słonecznikowe itp.) i niektóre rodzaje oleju roślinnego z wysoką zawartością kwasu oleinowego, takie jak olej z orzechów laskowych, olej słonecznikowy z wysoką zawartością kwasu oleinowego i oliwa z wytłoczyn z oliwek. Poziom wykrywalności zależy od rodzaju obcego oleju i odmiany oliwek. W odniesieniu do oleju z orzechów laskowych poziom wykrywalności często wynosi 5–15 %. Metoda ta nie pozwala na identyfikację rodzaju wykrytego obcego oleju a jedynie umożliwia wskazanie, czy dana oliwa z oliwek posiada czystość odmianową, czy nie.

2. ZASADA

Oliwę oczyszcza się metodą ekstrakcji do fazy stałej na wkładach z żelem krzemionkowym. Skład triglicerydów oznacza się za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, stosując detektor wskaźnika refraktometrycznego i propionitryl jako fazy ruchomej. Estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME) przygotowuje się z oczyszczonej oliwy w procesie metylowania przy użyciu zimnego roztworu wodorotlenku potasu w metanolu (załącznik X B), a następnie estry te poddaje się analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych przy użyciu wysokopolarnych kolumn (załącznik X A). Teoretyczny skład triglicerydów obliczany jest na podstawie składu kwasów tłuszczowych za pomocą programu komputerowego, przy założeniu losowego rozmieszczenia kwasów tłuszczowych w triglicerydach na pozycjach 1,3 oraz na pozycji 2, z pewnymi ograniczeniami dla nasyconych kwasów tłuszczowych na pozycji 2. Metoda obliczania jest zmodyfikowaną procedurą opisaną w załączniku XVIII. Szereg matematycznych algorytmów oblicza się na podstawie teoretycznych i eksperymentalnych (HPLC) składów triglicerydów, a uzyskane wartości są porównywane z wartościami zawartymi w bazie danych, uzyskanymi na podstawie badań oliwy z oliwek posiadającej czystość odmianową.

3. MATERIAŁ I ODCZYNNIKI

3.1. Oczyszczanie oliwy

3.1.1. Kolby stożkowe o pojemności 25 ml.

3.1.2. Szklane probówki o pojemności 5 ml z zakrętkami z uszczelką z PTFE.

3.1.3. Wkłady z żelem krzemionkowym, 1 g (6 ml), do ekstrakcji do fazy stałej (np. Waters, Massachusetts, Stany Zjednoczone Ameryki).

3.1.4. n-heksan, do analiz.

3.1.5. Rozpuszczalnik stanowiący mieszaninę n-heksanu/eteru dietylowego (87:13 ułamek objętościowy).

3.1.6. N-heptan, do analiz.

3.1.7. Aceton, do analiz.

3.2. Analiza triglicerydów metodą HPLC

3.2.1. Mikrostrzykawki (50 μL) i igły wprowadzające do HPLC.

3.2.2. Propionitryl o najwyższym stopniu czystości lub do HPLC (np. ROMIL, Cambridge, Zjednoczone Królestwo), używany jako faza ruchoma.

3.2.3. Kolumna HPLC (25 cm x 4 mm średnicy wewnętrznej) wypełniona fazą RP-18 (rozmiar cząsteczek 4 μm).

3.3. Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych

(zob. załącznik X B)

3.3.1. Metanol o zawartości wody nieprzekraczającej 0,5 %.

3.3.2. Heptan, do analiz.

3.3.3. Roztwór 2N wodorotlenku potasu w metanolu. Należy rozpuścić 1,1 g wodorotlenku potasu w 10 ml metanolu.

3.3.4. Zakręcane szklane probówki o pojemności 5 ml i nakrętki z połączeniem politetrafluoroetylenowym.

3.4. Analiza GC estrów metylowych kwasów tłuszczowych

(Zob. metoda oznaczania nienasyconych kwasów tłuszczowych trans metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych określona w załączniku X A).

3.4.1 Mikrostrzykawki (5 μL) i igły wprowadzające do GC.

3.4.2 Wodór lub hel jako gaz nośny.

3.4.3 Wodór i tlen do detektora płomieniowo-jonizacyjnego.

3.4.4 Azot lub hel jako pomocniczy gaz nośny.

3.4.5. Kolumna kapilarna wypełniona żelem krzemionkowym (50–60 m x 0,25– 0,30 mm średnicy wewnętrznej) pokryta fazą cyjanopropylopolisiloksanu lub cyjanopropylofenylosiloksanu (SP-2380 lub podobną) o grubości powłoki wynoszącej 0,20–0,25 μm.

4. APARATURA

4.1. Aparatura próżniowa do ekstrakcji do fazy stałej.

4.2. Wyparka rotacyjna.

4.3. Urządzenia HPLC obejmujące:

4.3.1. degazer do fazy ruchomej;

4.3.2. zawór do nastrzykiwania Rheodyne z pętlą 10 μL;

4.3.3. wysokociśnieniową jednostkę pompującą;

4.3.4. piec termostatyczny dla kolumny HPLC zdolny do utrzymywania temperatur niższych niż temperatura otoczenia (15–20°C), (np. typu Peltier);

4.3.5. detektor współczynnika refraktometrycznego;

4.3.6. skomputeryzowany system gromadzenia danych wraz z programem do całkowania.

4.4 Urządzenia do chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych omówione w załączniku X A, wyposażone w:

4.4.1. dozownik do nastrzykiwania z podziałem strumienia;

4.4.2. detektor płomieniowo-jonizacyjny;

4.4.3. piec z możliwością programowania temperatury;

4.4.4. skomputeryzowany system gromadzenia danych wraz z programem do całkowania.

4.5. Komputer z programem Microsoft EXCEL.

5. PROCEDURA ANALITYCZNA

5.1. Oczyszczanie oliwy

Wkład SPE z żelem krzemionkowym należy umieścić w elucyjnej aparaturze próżniowej i przemyć 6 ml heksanu w warunkach próżni. Aby zapobiec wysychaniu kolumny, należy przywrócić normalne ciśnienie i umieścić pod wkładem kolbę stożkową. Do kolumny wprowadzić roztwór oliwy (około 0,12 g) w 0,5 ml heksanu, przepuścić przez nią, a następnie eluować 10 ml mieszaniny heksanu i eteru dietylowego (3.1.5) (87:13 ułamek objętościowy) w próżni. Eluowany rozpuszczalnik należy poddać homogenizacji i wlać w przybliżeniu połowę jego objętości do innej kolby stożkowej. Oba roztwory należy oddzielnie odparować do suchości w wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej. Na potrzeby analizy triglicerydów jedną z pozostałości należy rozpuścić w 1 ml acetonu (zob. pkt 5.2 akapit pierwszy) i wlać do zakręcanej szklanej probówki o pojemności 5 ml. Na potrzeby przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych drugą pozostałość należy rozpuścić w 1 ml n-heptanu i wlać do drugiej zakręcanej szklanej probówki o pojemności 5 ml.

Uwaga: oczyszczanie oliwy można przeprowadzić na kolumnie z żelem krzemionkowym, jak opisano w metodzie 2.507 IUPAC.

5.2. Analiza triglicerydów metodą HPLC

Zestawić system HPLC, utrzymując kolumnę w temperaturze 20°C i stosując propionitryl jako fazę ruchomą przy natężeniu przepływu wynoszącym 0,6 ml/min. Po uzyskaniu stabilnej linii podstawowej należy wstrzyknąć rozpuszczalnik; jeżeli występują zakłócenia linii podstawowej w obrębie 12–25 min., należy użyć innego rodzaju acetonu lub mieszaniny propionitrylu/acetonu (25:75) w celu rozpuszczenia próbki.

Uwaga: niektóre rodzaje acetonu powodują zakłócenia linii podstawowej we wspomnianym wyżej obrębie.

Wstrzyknąć 10 μl podwielokrotności roztworu oczyszczonej oliwy w acetonie (5 %). Wykonanie analizy trwa około 60 min. Temperatura pieca lub natężenie przepływu muszą być dostosowane w celu otrzymania chromatogramu podobnego do chromatogramu przedstawionego na rys. 1, na którym czas eluowania trioleinianu (pik 1) wynosi 15,5 min, a rozdzielczości między parami LLL/OLLn (pik 1 i 2) a OLL/OOLn (pik 4 i 5) są poprawne.

Wysokość piku 2 (OLLn+PoLL) musi osiągnąć poziom przynajmniej 3 % pełnej skali.

5.3. Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Należy dodać 0,1 mL roztworu 2N wodorotlenku potasu w metanolu do roztworu oczyszczonej oliwy w 1mL n-heptanu. Zakręcić mocno probówkę. Wstrząsać probówkę energicznie przez 15 sekund i pozostawić do momentu, w którym nastąpi rozwarstwienie i górna warstwa stanie się przejrzysta (5 minut). Roztwór n-heptanu jest gotowy do wstrzyknięcia do chromatografu gazowego. Roztwór może być pozostawiony w temperaturze pokojowej na maksymalnie 12 godzin.

5.4. Analiza GC estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Należy zastosować procedurę opisaną w metodzie oznaczania nienasyconych kwasów tłuszczowych trans (zob. załącznik X A).

Zestawić system GC w temperaturze pieca 165°C. Zalecana temperatura pieca jest regulowania termostatem na poziomie 165°C przez 10 min, a następnie podnoszona do 200°C na 1,5°C/min. Zaleca się ustawienie temperatury dozownika do nastrzykiwania na 220°C–250°C, aby zminimalizować tworzenie się kwasów tłuszczowych trans (zob. załącznik X A). Temperaturę detektora ustawić na 250°C. Użyć wodoru lub helu jako gazu nośnego pod ciśnieniem w głowicy kolumny około 130 kPa. Wstrzykiwana objętość w trybie podziału strumienia wynosi 1μL.

Należy uzyskać chromatogram podobny do chromatogramu przedstawionego na rys. 2. Szczególną uwagę należy zwrócić na rozdzielczości między C18:3 a C:20:1 (pik C18:3 musi pojawić się przed pikiem C20:1). Aby osiągnąć wymienione warunki, należy zoptymalizować temperaturę początkową lub ciśnienie w głowicy kolumny. Skorygować warunki pracy dozownika (temperatura, stosunek podziału, objętość wprowadzanej próbki), aby zminimalizować odróżnianie kwasu palmitynowego i kwasu oleopalmitynowego.

Aby określić wartości izomerów trans, wysokość piku C20:0 musi być na poziomie około 20 % pełnej skali. W przypadku zakłócenia piku C18:0 należy ograniczyć wielkość próbki.

6. CAŁKOWANIE PIKÓW CHROMATOGRAFICZNYCH

6.1. Chromatogram HPLC

Na rys. 1 przedstawiono typowy chromatogram HPLC triglicerydów oczyszczonej oliwy. Do celów całkowania pików należy wyznaczyć trzy linie podstawowe: pierwszą, między początkiem piku 1 a końcem piku 3; drugą, między początkiem piku 4 a doliną przed pikiem 8; oraz trzecią, między doliną poprzedzającą pik 8 a końcem piku 18.

Powierzchnia całkowita jest sumą powierzchni wszystkich pików (zidentyfikowanych i niezidentyfikowanych) od piku 1 do piku 18. Wartość procentową każdego piku określa się za pomocą następującego wzoru:

TAG_x (%) = 100 (A_x + A_T)

Wartości procentowe należy przedstawić z dokładnością do drugiego miejsca po przecinku.

6.2. Chromatogram GC

Na rys. 2 przedstawiono chromatogram GC alkilowych estrów kwasów tłuszczowych oczyszczonej oliwy z oliwek. Należy obliczyć wartości procentowe następujących kwasów tłuszczowych:

Estry etylowe i izomery trans mogą być nieobecne na chromatografie GC.

Powierzchnia całkowita (A_T) jest sumą wszystkich pików pojawiających się na chromatogramie od piku C14:0 do piku C24:0, z wyjątkiem piku odpowiadającego skwalenowi. Wartość procentową każdego piku oblicza się w następujący sposób:

FA_x (%) = 100 (A_x + A_T)

Wyniki należy przedstawić z dokładnością do drugiego miejsca po przecinku.

Do celów obliczeń programów komputerowych nie jest konieczne normalizowanie do 100, ponieważ odbywa się to automatycznie.

Rysunek 1

Chromatogram HPLC triglicerydów oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia „Chamlali” . Główne elementy składowe pików chromatograficznych

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tabela 1

Powtarzalność danych dotyczących oznaczania triglicerydów oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia metodą HPLC w temperaturze kolumny 20°C, przy zastosowaniu propionitrylu jako fazy ruchomej

Rysunek 2

Chromatogram GC alkilowych estrów kwasów tłuszczowych otrzymanych z oczyszczonej oliwy z wytłoczyn z oliwek w procesie transestryfikacji, przy użyciu zimnego roztworu wodorotlenku potasu w metanolu

7. WYKRYWANIE OLEJÓW OBCYCH W OLIWIE Z OLIWEK

Metoda obliczeniowa służąca do wykrywania olejów obcych w oliwie z oliwek, polegająca na porównywaniu algorytmów matematycznych z bazą danych utworzoną w oparciu o badania oliwy z oliwek posiadającej czystość odmianową, została przedstawiona w załączniku I do normy IOC/T.20/Doc. No 25.”.