BEQ

Równoważnik bioanalityczny

GC

Chromatografia gazowa

HRMS

Spektrometria masowa o wysokiej rozdzielczości

LRMS

Spektrometria masowa o niskiej rozdzielczości

PCB

Polichlorowane bifenyle

PCDD

Polichlorowane dibenzo-p-dioksyny

PCDF

Polichlorowane dibenzofurany

QC

Kontrola jakości

REP

Względny potencjał działania

TEF

Współczynnik równoważny toksyczności

TEQ

Równoważnik toksyczności

TCDD

Tetrachlorodibenzodioksyna

U

Rozszerzona niepewność pomiaru

Masa partii (w tonach)

Masa lub liczba podpartii

≥ 1 500

500 ton

> 300 oraz < 1 500

3 podpartie

≥ 50 oraz ≤ 300

100 ton

< 50

–

Masa partii (w tonach)

Masa lub liczba podpartii

≥ 15

15–30 ton

< 15

–

Masa lub objętość partii lub podpartii (w kg lub litrach)

Minimalna liczba próbek pierwotnych, które należy pobrać

< 50

3

50–500

5

> 500

10

Liczba opakowań lub jednostek w partii lub podpartii

Liczba opakowań lub jednostek, które należy pobrać

1–25

co najmniej 1 opakowanie lub jednostka

26–100

ok. 5 %, co najmniej 2 opakowania lub jednostki

> 100

ok. 5 %, maksymalnie 10 opakowań lub jednostek

1.

ZAKRES ZASTOSOWANIA

Wymogi ustanowione w niniejszym załączniku należy stosować w przypadku środków spożywczych analizowanych do celów urzędowych kontroli poziomów polichlorowanych dibenzo-p-dioksyn z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz polichlorowanych dibenzofuranów (PCDD/F) i dioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli (dioksynopodobnych PCB), a także dla innych celów regulacyjnych.

Monitorowanie obecności PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w środkach spożywczych przeprowadza się w dwóch różnych celach:

a) wybór próbek o poziomach PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczających najwyższe dopuszczalne poziomy lub progi podejmowania działań. Podejście to może wymagać zastosowania metody przesiewowej pozwalającej na oszczędną i skuteczną przepustowość próbek i zwiększającej w ten sposób szansę wykrycia nowych incydentów o wysokim stopniu narażenia i ryzyku dla zdrowia konsumentów. Metody przesiewowe mogą obejmować metody bioanalityczne i metody GC/MS. Ich stosowanie powinno mieć na celu unikanie wyników fałszywie ujemnych. Stężenie PCDD/F oraz sum PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach, które zawierają znaczące ich poziomy, należy oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej;

b) oznaczanie poziomów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach żywności przy wielu niskich poziomach tła. Jest to ważne dla śledzenia tendencji w czasie, oceny narażenia populacji i stworzenia bazy danych na potrzeby ewentualnej ponownej oceny progów podejmowania działań i najwyższych dopuszczalnych poziomów. Cel ten jest osiągany przy zastosowaniu metody potwierdzającej pozwalającej w sposób jednoznaczny identyfikować i oznaczać ilościowo PCDD/F i dioksynopodobne PCB na poziomie zainteresowania. Metody te można stosować do potwierdzania wyników uzyskanych metodami przesiewowymi oraz do oznaczania niskich poziomów tła w monitorowaniu żywności. Są one ważne także dla ustanowienia profili kongenerów w celu zidentyfikowania źródła ewentualnego zanieczyszczenia. Obecnie metody te wykorzystują chromatografię gazową wysokiej rozdzielczości lub spektrometrię masową wysokiej rozdzielczości (HRGC/HRMS).

2.

KLASYFIKACJA METOD POD WZGLĘDEM STOPNIA OZNACZALNOŚCI (¹)

Metody jakościowe dają odpowiedź tak/nie w odniesieniu do obecności interesującego analitu bez wskazania ilościowego stężenia przypuszczalnie występującego analitu. Metody te mogą dostarczać wyników półilościowych, ale wykorzystywane są wyłącznie w celu uzasadniania decyzji tak/nie, jako wskazanie poziomów powyżej lub poniżej pewnych zakresów, np. granicy wykrywalności, granicy oznaczalności lub wartości odcięcia.

Do kontroli najwyższych dopuszczalnych poziomów i progów podejmowania działań dla PCDD/F oraz związków dioksynopodobnych w żywności można zastosować metody przesiewowe, oparte na porównaniu wyniku analitycznego z wartością odcięcia i dające odpowiedź tak/nie dla wskazania ewentualnego przekroczenia poziomów zainteresowania. W tym celu wprowadzono metody bioanalityczne. Zasadniczo można opracować także metody fizykochemiczne, jednak w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów i progów podejmowania działań opierających się na TEQ oraz w odniesieniu do złożonej analizy wymagającej oznaczenia odpowiednich pojedynczych kongenerów brak jest praktycznych przykładów.

Metody półilościowe dają przybliżone wskazanie stężenia, które może być przydatne jako informacja o zakresie stężenia analitu i pomagać analitykowi przy podejmowaniu decyzji o zakresie kalibracji badania potwierdzającego, które należy następnie wykonać, oraz w celu kontroli jakości. Przykładami takich metod są:

– metody bioanalityczne, które mogą wykrywać interesujące anality, obejmować krzywą kalibracji, dawać odpowiedź tak/nie dla wskazania ewentualnego przekroczenia poziomu zainteresowania oraz pozwalać na uzyskiwanie wyników w postaci równoważników bioanalitycznych (BEQ), będących wskazaniem wartości TEQ w próbce,

– badania fizykochemiczne (np. GC-MS/MS lub GC/LRMS), gdzie wyznaczone parametry precyzji metody nie spełniają kryteriów dla badania ilościowego.

Metody ilościowe spełniają te same wymogi w odniesieniu do dokładności, zakresu oznaczania i precyzji, co metody potwierdzające. Jeżeli wymagane jest oznaczenie ilościowe, metody te powinny zostać zwalidowane jako metody potwierdzające, zgodnie z opisem w niniejszym dokumencie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

3.

INFORMACJE PODSTAWOWE

W celu obliczenia stężeń wyrażonych jako równoważniki toksyczności (TEQ) należy pomnożyć stężenia poszczególnych substancji w danej próbce przez ich odpowiednie współczynniki równoważne toksyczności (TEF), ustanowione przez Światową Organizację Zdrowia i wymienione w dodatku do niniejszego załącznika, a następnie zsumować je, co da łączne stężenie związków dioksynopodobnych wyrażone jako TEQ.

Metody przesiewowe i potwierdzające mogą być stosowane tylko do kontroli niektórych matryc, jeżeli metody te są dostatecznie czułe, aby w sposób wiarygodny wykrywać substancje na poziomie zainteresowania (próg podejmowania działań lub najwyższy dopuszczalny poziom).

4.

WYMAGANIA DOTYCZĄCE ZAPEWNIANIA JAKOŚCI

– Należy podjąć niezbędne środki dla uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego na każdym etapie pobierania i analizy próbek.

– Próbki należy przechowywać i transportować w pojemnikach szklanych, aluminiowych, polipropylenowych lub polietylenowych nadających się do tego celu i nie mających wpływu na poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach. Pojemnik na próbki należy oczyścić z pyłków papieru.

– Przechowywanie i przewożenie próbek należy przeprowadzać w sposób zachowujący integralność próbki środka spożywczego.

– W razie potrzeby każdą próbkę laboratoryjną należy drobno zemleć i dokładnie wymieszać w sposób gwarantujący pełną homogenizację (np. w sposób umożliwiający przesianie przez sito o oczku 1 mm); jeżeli zawartość wilgoci jest zbyt wysoka, próbki muszą zostać osuszone przed mieleniem.

– Duże znaczenie ma kontrola odczynników, aparatury i szkła laboratoryjnego pod kątem ewentualnego wpływu na wyniki oparte na TEQ lub BEQ.

– Należy wykonać analizę ślepej próby, obejmującą przeprowadzenie pełnej procedury analitycznej, ale bez próbki.

– W przypadku metod bioanalitycznych ważne jest, aby upewnić się, że szkło laboratoryjne i rozpuszczalniki stosowane podczas analizy są wolne od związków interferujących w wykrywaniu związków docelowych w zakresie roboczym. Szkło należy przemyć rozpuszczalnikami lub ogrzać do temperatur, w których z powierzchni usuwane są pozostałości PCDD/F, związków dioksynopodobnych i związków interferujących.

– Ilość próbki stosowanej do ekstrakcji musi być wystarczająca do spełnienia wymogów dotyczących wystarczająco niskiego zakresu roboczego, obejmującego stężenia na poziomie zainteresowania.

– Konkretne procedury przygotowania próbki stosowane do badanych produktów powinny być zgodne z międzynarodowymi wytycznymi.

– W przypadku ryb należy usunąć skórę, ponieważ najwyższy dopuszczalny poziom dotyczy mięsa bez skóry. Konieczne jest jednak dokładne i całkowite zdrapanie całego pozostałego mięsa i tkanki tłuszczowej z wewnętrznej strony skóry i dodanie ich do analizowanej próbki.

5.

WYMAGANIA DOTYCZĄCE LABORATORIÓW

– Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 laboratoria powinny być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z przewodnikiem ISO 58, aby zagwarantować, że w przeprowadzaniu analiz stosują system zapewniania jakości. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025.

– Profesjonalizm laboratoriów należy udowadniać stałym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach żywności i zakresach stężeń.

– Laboratoria stosujące przesiewowe metody analizy do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

6.

PODSTAWOWE WYMAGANIA DOTYCZĄCE PROCEDURY ANALITYCZNEJ DLA DIOKSYN (PCDD/F) I DIOKSYNOPODOBNYCH PCB

6.1.

Niski zakres roboczy i granica oznaczalności

– W przypadku PCDD/F wykrywalne ilości muszą znajdować się na poziomie femtogramów (10^–15 g) z uwagi na ekstremalną toksyczność niektórych spośród tych związków. W przypadku większości kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10^–9 g) jest już wystarczająca. Jednakże w przypadku oznaczania bardziej toksycznych kongenerów dioksynopodobnych PCB (w szczególności kongenerów non-orto), dolna granica zakresu roboczego musi znajdować się na poziomie pikogramów (10^–12 g).

6.2.

Wysoka selektywność (swoistość)

– Konieczne jest rozróżnienie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB od wielu innych współekstrahowanych i ewentualnie interferujących związków występujących w stężeniach do kilku razy wyższych od stężeń interesujących analitów. W przypadku metod GC/MS (chromatografia gazowa/spektometria masowa) konieczne jest rozróżnienie między różnymi kongenerami, takimi jako kongenery toksyczne (np. siedemnaście PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dwanaście dioksynopodobnych PCB) i pozostałe kongenery.

– Metody bioanalityczne powinny być w stanie wykrywać docelowe związki jako sumę PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB. Oczyszczanie próbki ma na celu usunięcie związków dających wyniki fałszywie ujemne lub związków, które mogą zmniejszać odpowiedź, powodując wyniki fałszywie ujemne.

6.3.

Wysoka dokładność (prawdziwość i precyzja, odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym)

– W przypadku metod GC/MS oznaczenie musi dostarczyć wiarygodnych szacunków rzeczywistego stężenia w próbce. Wysoka dokładność (dokładność pomiaru: stopień zgodności między wynikiem pomiaru a rzeczywistą lub domniemaną wartością mierzoną) jest konieczna, aby uniknąć odrzucenia wyniku analizy próbki z powodu słabej wiarygodności oznaczonego poziomu TEQ. Dokładność jest wyrażona jako prawdziwość (różnica między średnią wartością mierzoną w odniesieniu do analitu w certyfikowanym materiale a jego certyfikowaną wartością, wyrażona w procentach) i precyzja (RSD_R – względne odchylenie standardowe obliczone na podstawie wyników osiągniętych w warunkach odtwarzalności).

– W przypadku metod bioanalitycznych należy oznaczyć odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym.

6.4.

Walidacja w zakresie poziomu zainteresowania oraz pomiary ogólnej kontroli jakości

– Laboratoria muszą wykazać zdolność metody w zakresie poziomu zainteresowania, np. 0,5-, 1- i 2-krotność poziomu zainteresowania wraz z akceptowalną wartością współczynnika zmienności obliczonego dla wielokrotnych powtórzeń analizy podczas procedury walidacji lub rutynowej analizy.

– W ramach wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości należy regularnie przeprowadzać ślepe próby i badania z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analizy próbek kontrolnych (zwłaszcza certyfikowanych materiałów referencyjnych, jeżeli materiały takie są dostępne). Wykresy kontroli jakości dla ślepych prób, badań z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analiz próbek kontrolnych należy rejestrować i kontrolować, aby upewnić się, że zdolność jest zgodna z wymaganiami.

6.5.

Granica oznaczalności

– W przypadku bioanalitycznej metody przesiewowej ustanowienie granicy oznaczalności (LOQ) nie jest niezbędnym wymogiem, ale należy dowieść, że metoda pozwala na rozróżnienie między ślepą próbą a wartością odcięcia. Podając poziom BEQ, należy ustalić poziom zgłaszania, aby uwzględnić próbki wykazujące odpowiedź poniżej tego poziomu. Należy wykazać, że poziom zgłaszania jest różny od procedury ślepej próby co najmniej o współczynnik 3 przy odpowiedzi poniżej zakresu roboczego. W związku z powyższym należy go obliczyć z próbek zawierających związki docelowe w granicach wymaganego poziomu minimalnego, a nie ze współczynnika S/N lub ze ślepej próby.

– Granica oznaczalności (LOQ) dla metody potwierdzającej powinna wynosić ok. jednej piątej poziomu zainteresowania.

6.6.

Kryteria analityczne

– Dla uzyskania wiarygodnych wyników metodą potwierdzającą lub przesiewową należy spełnić poniższe kryteria dla wartości TEQ w odniesieniu do wartości BEQ, niezależnie do tego, czy są oznaczane jako całkowita wartość TEQ (jako suma PCDD/F i dioksynopodobnych PCB), czy oddzielnie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

6.7.

Szczegółowe wymagania dotyczące metod przesiewowych

– W metodach przesiewowych można stosować zarówno metody GC/MS, jak i metody bioanalityczne. W przypadku metod GC/MS zastosowanie mają wymagania ustanowione w pkt 7 niniejszego załącznika. W przypadku metod bioanalitycznych opierających się na oznaczeniach komórkowych zastosowanie mają szczegółowe wymogi ustanowione w pkt 8 niniejszego załącznika.

– Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metodę potwierdzającą.

– Weryfikacja zdolności metody przesiewowej jest wymagana podczas rutynowej analizy w drodze kontroli jakości analizy i walidacji metody podczas analizy. Należy prowadzić ciągły program kontroli wyników ujemnych.

– Należy sprawdzać, czy nie zachodzi ewentualne tłumienie odpowiedzi komórek i cytotoksyczność

20 % ekstraktów próbek należy analizować rutynowo metodą przesiewową z dodanym 2,3,7,8-TCDD i bez, zgodnym z poziomem zainteresowania, aby sprawdzić, czy odpowiedź jest ewentualnie tłumiona przez substancje interferujące obecne w ekstrakcie próbki. Zmierzone stężenie próbki wzbogaconej jest porównywane do sumy stężenia ekstraktu próbki niewzbogaconej i stężenia wzbogacenia. Jeżeli zmierzone stężenie jest o ponad 25 % niższe niż obliczone (zsumowane) stężenie, wskazuje to na ewentualne tłumienie sygnału, a odpowiednia próbka musi zostać przekazana do analizy metodą potwierdzającej GC/HRMS. Wyniki należy monitorować na wykresach kontroli jakości.

– Kontrola jakości próbek ujemnych

Około 2–10 % próbek ujemnych, zależnie od matrycy próbki i doświadczenia laboratorium, należy potwierdzić metodą GC/HRMS.

– Oznaczenie wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych z danych kontroli jakości

Należy oznaczyć wskaźnik ilości wyników fałszywie ujemnych z badań przesiewowych próbek poniżej i powyżej najwyższego dopuszczalnego poziomu lub progu podejmowania działań. Wskaźnik rzeczywistej ilości wyników fałszywie ujemnych nie powinien przekraczać 5 %.

Po uzyskaniu co najmniej 20 potwierdzonych wyników na matrycę/grupę matryc z kontroli jakości próbek ujemnych należy z tej bazy danych wyciągnąć wnioski dotyczące wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych. Do tych 20 wyników w celu oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych można także włączyć wyniki uzyskane na próbkach analizowanych w badaniach biegłości lub podczas incydentów wystąpienia zanieczyszczenia, obejmujące zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego stężenia. Próbki powinny obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

Chociaż badania przesiewowe powinny mieć na celu wykrywanie próbek przekraczających próg podejmowania działań, kryterium określania wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych jest najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności pomiaru metody potwierdzającej.

– Ewentualne dodatnie wyniki z badania przesiewowego powinny zawsze zostać zweryfikowane potwierdzającą metodą analizy (GC/HRMS). Próbki te mogą być też zastosowane do oceny odsetka wyników fałszywie dodatnich. W przypadku metod przesiewowych częstość wyników fałszywie dodatnich to odsetek wyników potwierdzonych jako ujemne metodą potwierdzającą GC/HRMS, które we wcześniejszych badaniach przesiewowych były podejrzewane jako dodatnie. Jednak ocena korzyści metody przesiewowej powinna być oparta na porównaniu próbek fałszywie dodatnich z całkowitą liczbą sprawdzonych próbek. Częstość ta musi być na tyle niska, aby stosowanie narzędzia przesiewowego było korzystne.

– Metody bioanalityczne przynajmniej w warunkach walidacji powinny dostarczyć wiarygodnego wskazania poziomu TEQ, obliczonego i wyrażonego jako BEQ.

– Także w przypadku metod bioanalitycznych przeprowadzonych w warunkach powtarzalności, wewnątrzlaboratoryjny RSD_r byłby zwykle niższy niż odtwarzalność RSD_R.

7.

SZCZEGÓŁOWE WYMAGANIA DOTYCZĄCE TECHNIK GC/HRMS W METODACH PRZESIEWOWYCH LUB POTWIERDZAJĄCYCH

7.1.

Wymagania ogólne

– Różnica między poziomem górnej i dolnej granicy nie powinna przekraczać 20 % dla środków spożywczych zanieczyszczonych na poziomie ok. 1 pg WHO-TEQ/g tłuszczu (na podstawie sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku środków spożywczych o niskiej zawartości tłuszczu stosuje się te same wymagania odnośnie do zanieczyszczeń na poziomie 1 pg WHO-TEQ/g produktu. W przypadku niższych poziomów zanieczyszczeń, np. 0,5 pg WHO-TEQ/g produktu, różnica między górną i dolną granicą może wynosić 25–40 %.

7.2.

Kontrola poziomów odzysku

– Rozpoczynając analizę, np. przed ekstrakcją, należy dodać wzorce wewnętrzne PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla ¹³C, oraz wzorce wewnętrzne dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla ¹³C w celu walidacji procedury analitycznej. Należy dodać co najmniej 1 kongener dla każdej grupy homologicznej, od tetra- do oktachlorowanego PCDD/F oraz co najmniej 1 kongener dla każdej grupy homologicznej dioksynopodobnych PCB (alternatywnie, co najmniej 1 kongener na każdy wyselekcjonowany jon widma masowego, rejestrujący funkcję służącą do monitorowania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod potwierdzających należy zastosować wszystkie siedemnaście wzorców wewnętrznych PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 i znakowanych izotopem węgla ¹³C oraz wszystkie dwanaście wzorców wewnętrznych dioksynopodobnych PCB znakowanych izotopem węgla ¹³C.

– Dla tych kongenerów, dla których nie zastosowano analogów znakowanych izotopem węgla ¹³C, należy również oznaczyć względne współczynniki odpowiedzi przez zastosowanie odpowiednich roztworów kalibracyjnych.

– W przypadku środków spożywczych pochodzenia roślinnego i środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego zawierających mniej niż 10 % tłuszczu dodawanie wzorców wewnętrznych przed ekstrakcją jest obowiązkowe. W przypadku środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego zawierających więcej niż 10 % tłuszczu wzorce wewnętrzne mogą zostać dodane przed albo po ekstrakcji tłuszczu. Zależnie od etapu, na którym wprowadza się wzorce wewnętrzne, a także zależnie od tego, czy wyniki podaje się w odniesieniu do produktu, czy do tłuszczu, należy dokonać właściwej walidacji skuteczności ekstrakcji.

– Przed analizą GC/MS należy dodać 1 lub 2 wzorce odzysku.

– Konieczna jest kontrola odzysku. W przypadku metody potwierdzającej, odzysk poszczególnych wzorców wewnętrznych musi mieścić się w zakresie od 60 do 120 %. Dopuszczalne są niższe lub wyższe wartości odzysku dla poszczególnych kongenerów, w szczególności dla niektórych hepta- i oktachlorowanych dibenzo-p-dioksyn i dibenzofuranów, jeżeli ich udział w wartości TEQ nie przekracza 10 % całkowitej wartości TEQ (na podstawie PCDD/F oraz dioksynopodobnych PCB). W przypadku metod przesiewowych GC/MS odzysk powinien miesić się w zakresie od 30 do 140 %.

7.3.

Usuwanie substancji interferujących

– Rozdzielenie PCDD/F od interferujących związków chlorowanych, takich jak niedioksynopodobne PCB czy polichlorowane difenyloetery, należy przeprowadzić przez zastosowanie odpowiednich technik chromatograficznych (najlepiej stosując jako wypełnienie kolumny florisil, tlenek glinu lub węgiel).

– Rozdzielanie izomerów metodą chromatografii gazowej musi być wystarczające (< 25% nakładania się pików pomiędzy 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

7.4.

Kalibracja przy zastosowaniu krzywej wzorcowej

– Zakres krzywej kalibracji powinien obejmować odpowiednie zakresy poziomów zainteresowania.

8.

SZCZEGÓŁOWE WYMAGANIA DOTYCZĄCE METOD BIOANALITYCZNYCH

Metody bioanalityczne oznaczają metody oparte na stosowaniu zasad biologicznych, np. oznaczenie wykorzystujące hodowle komórkowe, oznaczenie wykorzystujące receptor lub oznaczenie immunologiczne. W pkt 8 ustanowiono ogólne wymogi dla metod bioanalitycznych.

Metoda przesiewowa zasadniczo pozwala zaklasyfikować próbkę jako ujemną lub podejrzewaną jako dodatnią. W tym celu obliczony poziom BEQ jest porównywany z wartością odcięcia (zob. 8.3). Próbki poniżej wartości odcięcia są uznawane za ujemne, a próbki równe wartości odcięcia lub ją przekraczające – za podejrzewane jako dodatnie, wymagające analizy metodą potwierdzającą. W praktyce wartość BEQ odpowiadająca 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu może posłużyć jako najbardziej odpowiednia wartość odcięcia, zapewniająca wskaźnik ilości wyników fałszywie ujemnych poniżej 5 % i dopuszczalną częstość wyników fałszywie dodatnich. Przy odrębnych najwyższych dopuszczalnych poziomach dla PCDD/F i dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB sprawdzanie zgodności próbek bez frakcjonowania wymaga odpowiednich wartości odcięcia metodami biologicznymi dla PCDD/F. Dla sprawdzenia próbek przekraczających progi podejmowania działań jako wartość odcięcia wystarczyłby odpowiedni odsetek właściwego poziomu zainteresowania.

Ponadto w przypadku niektórych metod bioanalitycznych można podać indykatywny poziom wyrażony w BEQ dla próbek w zakresie roboczym i przekraczającym poziom zgłaszania (zob. 8.1.1. i 8.1.6.).

8.1.

Ocena czułości badania

8.1.1.

Wymagania ogólne

– Podczas obliczania stężenia z krzywej kalibracji TCDD wartości na dolnej i górnej granicy krzywej wykazywać będą wysoką zmienność (wysoki współczynnik zmienności, CV). Zakres roboczy to obszar, w którym CV jest mniejszy niż 15 %. Dolna granica zakresu roboczego (poziom zgłaszania) musi następnie zostać ustalona znacznie (co najmniej o współczynnik 3) powyżej procedury próby ślepej. Górna granica zakresu roboczego jest zwykle reprezentowana przez wartość EC₇₀ (70 % najwyższego skutecznego stężenia), ale jest niższa, jeżeli CV jest wyższy niż 15 % w tym zakresie. Zakres roboczy powinien być ustalony podczas walidacji. Wartości odcięcia (pkt 8.3) muszą mieścić się w zakresie roboczym.

– Roztwory standardowe i ekstrakty próbek należy zbadać co najmniej w duplikacie. Przy stosowaniu duplikatów roztwór standardowy lub ekstrakt kontrolny badany w 4–6 dołkach rozmieszczonych na płytce powinien wywołać odpowiedź lub dać stężenie (możliwe tylko w zakresie roboczym) w oparciu o CV < 15 %.

8.1.2.

Kalibracja

8.1.2.1.

Kalibracja przy zastosowaniu krzywej wzorcowej

– Poziomy w próbkach można oszacować przez porównanie czułości badania z krzywą kalibracyjną TCDD (lub PCB 126 albo mieszaniny wzorcowej PCDD/F/dioksynopodobnych PCB) w celu obliczenia poziomu BEQ w ekstrakcie, a następnie w próbce.

– Krzywe kalibracji powinny zawierać 8–12 stężeń (co najmniej w duplikacie) z wystarczającą ilością stężeń w dolnych zakresach krzywej (zakres roboczy). Szczególną uwagę należy zwrócić na jakość dopasowania krzywej w roboczym zakresie. Wartość R² jako taka ma niewielką lub żadną wartość w szacowaniu dopasowania w regresji nieliniowej. Lepsze dopasowanie jest osiągane poprzez minimalizowanie różnicy między obliczanym a obserwowanym poziomem w zakresie roboczym krzywej (np. przez minimalizowanie sumy kwadratów reszt).

– Szacowany poziom w ekstrakcie próbki jest następnie korygowany o poziom BEQ obliczany dla ślepej próby matrycy/rozpuszczalnika (aby uwzględnić zanieczyszczenia z zastosowanych rozpuszczalników i chemikaliów) oraz pozorny odzysk (obliczany z poziomu BEQ odpowiednich próbek referencyjnych z reprezentatywnymi profilami kongenerów w granicach poziomu zainteresowania). Dla przeprowadzenia korekty odzysku pozorny odzysk musi zawsze mieścić się w wymaganym zakresie (zob. pkt 8.1.4.). Próbki referencyjne stosowane do korekty odzysku muszą być zgodne z wymogami podanymi w pkt 8.2.

8.1.2.2.

Kalibracja przy zastosowaniu próbek referencyjnych

Alternatywnie można zastosować krzywą kalibracji przygotowaną na co najmniej 4 próbkach referencyjnych (zob. pkt 8.2.: jedna ślepa próba matrycowa plus trzy próbki referencyjne o wartości 0,5-, 1- i 2-krotnego poziomu zainteresowania) w granicach poziomu zainteresowania, eliminując potrzebę korekty o próbę ślepą i odzysk. W takim przypadku czułość badania odpowiadająca 2/3 najwyższego dopuszczalnego poziomu (zob. 8.3.) może zostać obliczona bezpośrednio z tych próbek i zastosowana jako wartość odcięcia. Dla sprawdzenia próbek przekraczających progi podejmowania działań jako wartość odcięcia wystarczyłby odpowiedni procent tych progów podejmowania działań.

8.1.3.

Oddzielne oznaczanie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB

Ekstrakty można rozdzielać na frakcje zawierające PCDD/F i dioksynopodobne PCB, umożliwiając oddzielne oznaczanie poziomów TEQ dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB (wyrażonych w BEQ). Do oceny wyników dla frakcji zawierającej dioksynopodobne PCB najlepiej zastosować standardową krzywą kalibracyjną PCB 126.

8.1.4.

Odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym

„ Odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym” powinien zostać obliczony na odpowiednich próbkach referencyjnych z reprezentatywnymi profilami kongenerów w granicach poziomu zainteresowania i wyrażony jako odsetek poziomu BEQ w porównaniu do poziomu TEQ. Zależnie od typu badania i zastosowanych TEF (¹) różnice między czynnikami TEF i REP dla dioksynopodobnych PCB mogą spowodować niski odzysk dla dioksynopodobnych PCB w porównaniu z PCDD/F. Dlatego, jeżeli przeprowadzane jest osobne oznaczenie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB, odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym powinien wynosić: dla dioksynopodobnych PCB: 25–60 %, dla PCDD/F: 50– 130 % (zakresy stosowane są do krzywej kalibracji TCDD). Ponieważ udział dioksynopodobnych PCB w sumie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB może różnić się zależnie od różnych matryc i próbek, odzysk uzyskany w oznaczeniu biologicznym dla sumy odzwierciedla te zakresy i powinien wynosić od 30 % do 130 %.

8.1.5.

Kontrola poziomów odzysku na potrzeby oczyszczania

– Strata związków podczas oczyszczania powinna zostać sprawdzona podczas walidacji. Ślepą próbę wzbogaconą mieszaniną różnych kongenerów należy przekazać do oczyszczania (co najmniej n = 3), a odzysk i zmienność sprawdzić metodą GC/HRMS. Odzysk powinien wynosić od 60 do 120 % szczególnie dla kongenerów mających ponad 10 % udział w poziomie TEQ w różnych mieszaninach.

8.1.6.

Poziom zgłaszania

– Przy zgłaszaniu poziomów BEQ należy określić poziom zgłaszania na odpowiednich próbkach matrycy, obejmujących typowe profile kongenerów, ale nie z krzywej kalibracji wzorców ze względu na niską precyzję w dolnym zakresie krzywej. Należy uwzględnić wpływy z ekstrakcji i oczyszczania. Poziom zgłaszania należy ustalić znacznie (co najmniej o współczynnik 3) powyżej procedury próby ślepej.

8.2.

Stosowanie próbek referencyjnych

– Próbki referencyjne reprezentują matrycę próbki, profile kongenerów i zakresy stężeń dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w granicach poziomu zainteresowania (najwyższy dopuszczalny poziom lub próg podejmowania działań).

– Ślepą próbę procedury lub najlepiej ślepą próbę matrycową oraz próbkę referencyjną na poziomie zainteresowania należy włączyć do każdej serii badanej. Próbki te muszą zostać ekstrahowane i zbadane w tym samym czasie w identycznych warunkach. Próbka referencyjna musi dawać wyraźnie podwyższoną odpowiedź w porównaniu ze ślepą próbą, gwarantując przydatność badania. Próbki te można zastosować do korekty ślepej próby i korekty odzysku.

– Próbki referencyjne wybrane do przeprowadzenia korekty odzysku powinny być reprezentatywne dla próbek badanych, co oznacza, że profile kongenerów nie powinny prowadzić do niedoszacowania poziomów.

– Można włączyć dodatkowe próbki referencyjne zawierające np. 0,5- i 2-krotność poziomu zainteresowania, aby wykazać właściwą zdolność badania w zakresie zainteresowania do celów kontroli poziomu zainteresowania. Razem próbki te można zastosować do obliczania poziomów BEQ w próbkach badanych (8.1.2.2).

8.3.

Oznaczenie wartości odcięcia

Należy ustalić relację między wynikami bioanalitycznymi wyrażonymi w BEQ a wynikami GC/HRMS wyrażonymi w TEQ (np. w drodze kalibracji przy zastosowaniu dopasowanej matrycy, z użyciem próbek referencyjnych wzbogaconych o wartość 0-, 0,5-, 1- i 2-krotną najwyższego dopuszczalnego poziomu przy 6 powtórzeniach na każdym poziomie (n = 24)). Z tej relacji można oszacować współczynniki korekcji (ślepa próba i odzysk), jednak należy je sprawdzić w każdej serii badanej przez włączenie ślepej próby procedury/matrycowej i próbek odzysku (8.2).

Wartości odcięcia należy ustalić dla decyzji o zgodności próbki z najwyższymi dopuszczalnymi poziomami lub dla celów kontroli progów podejmowania działań, jeżeli ma to znaczenie, przy odpowiednich poziomach zainteresowania ustanowionych albo dla PCDD/F i dla dioksynopodobnych PCB osobno, albo dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB. Są one reprezentowane przez dolną granicę dystrybucji wyników bioanalitycznych (skorygowaną o próbę ślepą i odzysk), odpowiadającą poziomowi decyzji GC/HRMS w oparciu o 95 % przedział ufności, zakładając wskaźnik ilości wyników fałszywie ujemnych na poziomie < 5 % oraz RSD_R < 25 %. Poziom decyzji GC/HRMS to najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności pomiaru.

W praktyce wartość odcięcia (w BEQ) może zostać obliczona w następujący sposób (zob. rysunek 1):

8.3.1.

Zastosowanie dolnego pasma 95 % przedziału predykcji przy poziomie decyzji GC/HRMS

Wartość odcięcia =

8.3.2.

Obliczenie z wyników bioanalitycznych (skorygowanych o próbę ślepą i odzysk) wielokrotnych analiz próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzji GC/HRMS, jako dolna granica dystrybucji danych przy odpowiadającej średniej wartości BEQ:

8.3.3.

Obliczenie średniej wartości wyników bioanalitycznych (w BEQ, skorygowanych o próbę ślepą i odzysk) z wielokrotnej analizy próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na 2/3 poziomu zainteresowania. Jest to oparte na obserwacji, że ten poziom będzie mieścił się w granicach odcięcia oznaczonych zgodnie z pkt 8.3.1 lub 8.3.2.

Rysunek 1

Obliczenie wartości odcięcia w oparciu o 95 % przedział ufności przy założeniu wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych na poziomie < 5 % oraz RSD_R < 25 %: 1. z dolnego pasma 95 % przedziału predykcji na poziomie decyzji HRGC/HRMS, 2. z wielokrotnej analizy próbek (n ≥ 6) zanieczyszczonych na poziomie decyzji HRGC/HRMS, jako dolna granica dystrybucji danych (reprezentowana na rysunku przez krzywą dzwonową) przy odpowiadającej średniej wartości BEQ.

8.3.4.

Ograniczenia wartości odcięcia:

Wartości odcięcia oparte na BEQ obliczone z RSD_R uzyskanego podczas walidacji przy zastosowaniu ograniczonej liczby próbek o różnych profilach matryc/kongenerów mogą być wyższe niż wartości zainteresowania oparte na TEQ ze względu na lepszą precyzję niż precyzja osiągana rutynowo, kiedy trzeba kontrolować nieznane spektrum możliwych profili kongenerów. W takich przypadkach wartości odcięcia należy obliczać z RSD_R = 25 % lub należy wybrać 2/3 poziomu zainteresowania.

8.4.

Parametry zdolności metody

– Ponieważ w metodach bioanalitycznych niemożliwe jest stosowanie wzorców wewnętrznych, należy przeprowadzić badania powtarzalności pozwalające na uzyskanie informacji o odchyleniu standardowym w obrębie jednej serii badanej i między tymi seriami. Powtarzalność powinna być na poziomie poniżej 20 %, odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna – poniżej 25 %. Wyniki te powinny opierać się na obliczonych poziomach w BEQ po korekcie próby ślepej i odzysku.

– Jako część procesu walidacji należy wykazać, że badania pozwalają na odróżnienie między próbą ślepą a poziomem wartości odcięcia, umożliwiając identyfikację próbek powyżej odpowiadającej wartości odcięcia (zob. 8.1.2).

– Należy zdefiniować docelowe związki, możliwe interferencje oraz najwyższy dopuszczalny poziom sygnału próby ślepej.

– Procent odchylenia standardowego w odpowiedzi lub stężeniu obliczonym z odpowiedzi (możliwy tylko w zakresie roboczym) potrójnego oznaczenia ekstraktu próbki nie powinien przekraczać 15 %.

– Do oceny zdolności metody bioanalitycznej w stałym okresie należy zastosować nieskorygowane wyniki próbek referencyjnych wyrażone w BEQ (próba ślepa i poziom zainteresowania).

– Wykresy kontroli jakości dla próby ślepej procedury i każdego typu próbki referencyjnej należy zarejestrować i sprawdzić, aby upewnić się, że zdolność analityczna jest zgodna z wymogami, w szczególności dla próby ślepej procedury w odniesieniu do wymaganej minimalnej różnicy między dolną granicą zakresu roboczego oraz dla próbek referencyjnych w odniesieniu do odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej. Próby ślepe procedury muszą być dobrze kontrolowane, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych podczas odejmowania.

– Należy zgromadzić wyniki z analiz GC/HRMS podejrzanych próbek oraz 2– 10 % próbek ujemnych (co najmniej 20 próbek na matrycę) i zastosować je do oceny zdolności metody przesiewowej oraz związku między BEQ i TEQ. Ta baza danych może zostać zastosowana do ponownej oceny wartości odcięcia stosowanej do rutynowych próbek dla zwalidowanych matryc.

– Zdolność metody można także wykazać przez uczestnictwo w badaniach biegłości. Wyniki z próbek analizowanych w badaniach biegłości, obejmujących zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego poziomu, mogą zostać włączone do oceny wskaźnika ilości wyników fałszywie ujemnych, jeżeli laboratorium może wykazać zdolność metody. Próbki powinny obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

– Podczas incydentów można ponownie ocenić wartości odcięcia, odzwierciedlające konkretne profile matryc i kongenerów pojedynczego incydentu.

9.

PRZEDSTAWIANIE WYNIKÓW

Metody potwierdzające

– Jeśli zastosowana procedura analityczna to umożliwia, wyniki analiz powinny zawierać poziomy poszczególnych kongenerów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB i być przedstawiane jako ich górne, dolne i średnie granice, aby zawrzeć w sprawozdaniu maksymalną ilość informacji umożliwiających dokonanie interpretacji wyników zgodnie z konkretnymi wymaganiami.

– Sprawozdanie powinno także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla próbek żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie lub progu podejmowania działań ustalonych w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem); w przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

– Należy udostępnić poziomy odzysku poszczególnych wzorców wewnętrznych, jeżeli te poziomy odzysku znajdują się poza zakresem wymienionym w pkt 7.2 lub przekraczają najwyższy dopuszczalny poziom, a w pozostałych przypadkach na żądanie.

– Ponieważ przy ustalaniu zgodności próbki uwzględnia się niepewność pomiaru, należy podać również ten parametr. W związku z powyższym wyniki badań należy podawać jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U rozszerzoną niepewność pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia w wysokości 2, który daje wynik w przedziale ufności ok. 95 %. W przypadku odrębnego oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB należy zastosować sumę szacowanej niepewności rozszerzonej dla odrębnych wyników analitycznych dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odniesieniu do sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

– Jeżeli niepewność pomiaru jest uwzględniana przez zastosowanie CCα (zob. załącznik II pkt IV.2), należy podać również ten parametr.

– Wyniki są wyrażane w tych samych jednostkach i z (co najmniej) tą samą liczbą cyfr znaczących, co najwyższe dopuszczalne poziomy określone w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006.

Bioanalityczne metody przesiewowe

– Wynik badań przesiewowych wyrażany jest jako zgodny lub podejrzewany o niezgodność („podejrzany”).

– Ponadto można podać wynik dla PCDD/F lub dla dioksynopodobnych PCB wyrażony w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ) (nie TEQ) (zob. załącznik III pkt 2).

– Jeżeli podawana jest niepewność pomiaru obliczonego poziomu BEQ, np. jako odchylenie standardowe, musi być oparta co najmniej na trzykrotnej analizie (obejmującej ekstrakcję, oczyszczanie i oznaczenie czułości badania) próbki.

– Próbki dające odpowiedź poniżej poziomu zgłaszania należy oznaczyć jako poniżej poziomu zgłaszania.

– W sprawozdaniu, dla każdego typu matrycy próbki, należy podać poziom zainteresowania (najwyższy dopuszczalny poziom, próg podejmowania działań), na którym opiera się ocena.

– W sprawozdaniu należy podać zastosowany rodzaj badania, podstawowe zasady badania i rodzaj kalibracji.

– Sprawozdanie powinno także zawierać opis metody zastosowanej do ekstrakcji PCDD/F, dioksynopodobnych PCB i tłuszczów. W sprawozdaniu należy oznaczyć i podać zawartość tłuszczu w próbce dla próbek żywności o najwyższym dopuszczalnym poziomie lub progu podejmowania działań ustalonych w odniesieniu do tłuszczu i oczekiwanym stężeniu tłuszczu w zakresie 0–2 % (zgodnie z obowiązującym prawodawstwem); w przypadku pozostałych próbek oznaczenie zawartości tłuszczu jest opcjonalne.

Kongener

Wartość TEF

Kongener

Wartość TEF

Dibenzo-p-dioksyny („PCDD”)

„Dioksynopodobne” PCB non-orto PCB oraz mono-orto PCB

2,3,7,8-TCDD

1

1,2,3,7,8-PeCDD

1

Non-orto PCB

1,2,3,4,7,8-HxCDD

0,1

PCB 77

0,0001

1,2,3,6,7,8-HxCDD

0,1

PCB 81

0,0003

1,2,3,7,8,9-HxCDD

0,1

PCB 126

0,1

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD

0,01

PCB 169

0,03

OCDD

0,0003

Dibenzofurany („PCDF”)

Mono-orto PCB

2,3,7,8-TCDF

0,1

PCB 105

0,00003

1,2,3,7,8-PeCDF

0,03

PCB 114

0,00003

2,3,4,7,8-PeCDF

0,3

PCB 118

0,00003

1,2,3,4,7,8-HxCDF

0,1

PCB 123

0,00003

1,2,3,6,7,8-HxCDF

0,1

PCB 156

0,00003

1,2,3,7,8,9-HxCDF

0,1

PCB 157

0,00003

2,3,4,6,7,8-HxCDF

0,1

PCB 167

0,00003

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF

0,01

PCB 189

0,00003

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF

0,01

OCDF

0,0003

Zastosowane skróty: „T” – tetra (cztero); „P” – penta (pięcio); „Hx” – heksa (sześcio); „Hp” – hepta (siedmio); „O” – okta (ośmio); „ CDD” – chlorodibenzodioksyna; „CDF” – chlorodibenzofuran; „CB” – chlorobifenyl.

Względna intensywność jonów kwalifikowanych w porównaniu z jonem docelowym

GC-EI-MS

(względne odchylenie)

GC-CI-MS, GC-MSⁿ

(względne odchylenie)

> 50 %

+/– 10 %

+/– 20 %

> 20 % do 50 %

+/– 15 %

+/– 25 %

> 10 % do 20 %

+/– 20 %

+/– 30 %

≤ 10 %

+/– 50 % (*)

+/– 50 % (*)

(*) Dostępna wystarczająca liczba fragmentów masy o względnej intensywności > 10 %, dlatego nie zaleca się stosowania jonów pomocniczych o względnej intensywności mniejszej niż 10 % w porównaniu z jonem docelowym.

Prawdziwość

– 30 % do + 30 %

Precyzja pośrednia (RSD%)

≤ 20 %

Różnica między wyższą a niższą granicą obliczenia

≤ 20 %