I. Kryteria diagnozowania ISA oraz ustanawiania stref, niektórych środków kontroli i urzędowego nadzoru

I.1. Ogólne zasady diagnozowania ISA

Uzasadnione podstawy podejrzenia ryb o zakażenie ISAV zostały przedstawione w części I.2 niniejszego Załącznika. Państwa Członkowskie zobowiązane są zapewnić, aby w następstwie podejrzenia ryb w gospodarstwie o zakażenie wirusem ISAV przeprowadzono możliwie jak najszybciej urzędowe dochodzenie mające na celu potwierdzenie występowania choroby lub jej wykluczenie, z zastosowaniem inspekcji i badań klinicznych oraz przez pobranie i dobór próbek i metod badania laboratoryjnego, zgodnie z częściami III-VI niniejszego Załącznika. W celu urzędowego potwierdzenia występowania ISA konieczne jest spełnienie jednego z trzech zestawów kryteriów ustanowionych w części I.3 niniejszego Załącznika.

I.2. Podejrzenie zakażenia ISA

I.2.1. Podejrzenie o występowanie ISA ma miejsce w przypadku spełnienia przynajmniej jednego z następujących kryteriów:

a) wyniki badań pośmiertnych wskazują na występowanie ISA, wraz z występowaniem lub przy braku objawów klinicznych choroby. Wyniki badań pośmiertnych oraz kliniczne objawy choroby są zgodne z tymi ustanowionymi w bieżącym wydaniu Podręcznika diagnozowania chorób zwierząt wodnych OIE;

b) izolacja lub rozpoznanie ISAV w hodowli komórkowej z jednej próbki pobranej od ryb w gospodarstwie w sposób opisany w części III;

c) odpowiednie dowody na obecność ISAV, na podstawie dwóch niezależnych badań laboratoryjnych takich jak RT-PCR (część IV) oraz IFAT (część V);

d) przeniesienie żywych ryb do gospodarstwa, co do którego istnieją uzasadnione powody, aby podejrzewać występowanie ISA w chwili przeniesienia ryb;

e) w przypadku, gdy dochodzenie ujawnia inne znaczne powiązania z gospodarstwami podejrzewanymi o występowanie ISA, lub w których potwierdzono występowanie przedmiotowej choroby.

I.2.2. Podejrzenie ISA można wykluczyć w przypadku, gdy stałe dochodzenie polegające na przeprowadzaniu przynajmniej jednej inspekcji miesięcznie przez okres sześciu miesięcy nie ujawnia żadnych znaczących dowodów na występowanie ISA.

I.3. Potwierdzenie ISA

Występowanie ISA można uznać za potwierdzone w przypadku spełnienia kryteriów określonych w lit. a) lub b) albo c):

a) objawy kliniczne i wyniki badań pośmiertnych wskazują na występowanie ISA, zgodnie z bieżącym wydaniem Podręcznika diagnozowania chorób zwierząt wodnych OIE, łącznie z rybami śniętymi, słabymi i zachowującymi się w sposób anormalny, objawami niedokrwistości, innymi wynikami badań pośmiertnych i zaobserwowanymi zmianami patologicznymi, a ISAV wykryto za pomocą jednej lub kilku z następujących metod:

(i) izolacja i rozpoznanie ISAV w hodowli komórkowej z przynajmniej jednej próbki pobranej od ryb w gospodarstwie w sposób opisany w części III;

(ii) wykrycie ISAV za pomocą RT-PCR, z zastosowaniem metod opisanych w części IV,

(iii) wykrycie ISAV w tkankach lub preparatach tkankowych za pomocą swoistych przeciwciał wobec wirusa ISAV (np. IFAT na odciskach nerek, stosownie do opisu w części V);

b) izolacja i rozpoznanie ISAV w dwóch próbkach pobranych od jednej lub kilku ryb w badanym gospodarstwie przy dwóch różnych okazjach, z zastosowaniem metody opisanej w części III;

c) izolacja i rozpoznanie ISAV z przynajmniej jednej próbki pobranej od ryb w gospodarstwie w sposób opisany w części III, przy dowodach potwierdzających występowanie ISAV w preparatach tkankowych ryb w gospodarstwie, z zastosowaniem RT-PCR (część IV) lub IFAT (część V).

I.4. Kryteria ustanawiania i odwoływania stref kontroli oraz urzędowego nadzoru w następstwie podejrzenia i potwierdzenia występowania ISA.

I.4.1. Do celów ustanawiania urzędowego programu nadzoru koncentrującego się na obszarach ryzyka, w pobliżu gospodarstwa podejrzewanego o występowanie ISA, lub w którym występowanie choroby zostało potwierdzone, Państwa Członkowskie ustanawiają odpowiednie strefy kontroli i okręgi zagrożone.

I.4.2. Ustanawiane strefy określa się w oparciu o analizę jednostkowych przypadków w odniesieniu do dalszego rozprzestrzeniania się choroby. Zgodnie z sytuacją epizootiologiczną, dany obszar zlewisk lub strefę przybrzeżną:

- określa się jako strefę kontroli, lub

- w przypadku rozległych obszarów zlewisk lub stref przybrzeżnych, można je podzielić na strefę kontroli i okręg zagrożony, jeżeli nie ogranicza to zapobiegania rozprzestrzenianiu się ISA.

Ponadto można ustanowić dodatkowe okręgi zagrożone, poza obszarem zlewiska czy strefą przybrzeżną.

I.4.3. Podstawowymi czynnikami, jakie należy uwzględnić w przypadku ustanawiania przedmiotowych stref są czynniki mające wpływ na ryzyko rozprzestrzenienia się choroby na ryby hodowlane i ryby żyjące w otwartych zbiornikach wodnych, takie jak: ilość, współczynnik zgonów i rozmieszczenie przypadków zgonu ryb w gospodarstwach podejrzewanych lub zakażonych wirusem ISAV; przyczyna zgonów w danym gospodarstwie; odległość od sąsiednich gospodarstw i zagęszczenie tych gospodarstw; gospodarstwa pozostające w kontakcie; gatunki występujące w gospodarstwach; sposób zarządzania w gospodarstwach dotkniętych zakażeniem oraz w sąsiednich gospodarstwach; warunki hydrodynamiczne oraz inne czynniki o znaczeniu epidemiologicznym, rozpoznane w ramach dochodzenia epizootycznego przeprowadzonego zgodnie z art. 5 ust. 2 i art. 8 dyrektywy 93/53/EWG.

I.4.4. W odniesieniu do ustanawiania stref stosuje się następujące minimalne kryteria.

I.4.4.1. Państwo Członkowskie ustanawia „strefę kontroli” w najbliższym sąsiedztwie gospodarstwa, w którym potwierdzono występowanie ISAV, w następujący sposób:

- w strefach przybrzeżnych: obszar znajdujący się w promieniu przynajmniej jednego zakresu pływów lub w promieniu przynajmniej 5 km, licząc od gospodarstwa, w którym potwierdzono występowanie ISAV, lub równoważny obszar, określony zgodnie z odpowiednimi danymi hydrodynamicznymi lub epidemiologicznymi, albo

- strefy śródlądowe: cały obszar zlewiska gospodarstwa zakażonego ISAV; w przypadku rozległych obszarów zlewisk, Państwo Członkowskie może ograniczyć strefę do części obszaru zlewiska, pod warunkiem, że nie wpływa to ujemnie na zapobieganie rozprzestrzenianiu się ISA.

I.4.4.2. „Tymczasową strefę kontroli” ustanawia się w przypadku podejrzenia występowania ISA, w oparciu o te same kryteria, co w przypadku strefy kontroli.

I.4.4.3. „Okręg zagrożony” Państwo Członkowskie ustanawia, w razie potrzeby, poza strefą kontroli, na obszarach, w odniesieniu do których nie stwierdzono konieczności prowadzenia intensywnego nadzoru, i odpowiada on:

- w strefach przybrzeżnych: obszarowi wokół strefy kontroli nakładających się stref zakresów pływów, obszarowi wokół strefy kontroli, o promieniu 10 km od środka strefy kontroli, lub równoważnemu obszarowi wyznaczonemu zgodnie z odpowiednimi danymi hydrodynamicznymi lub epidemiologicznymi, albo

- w strefach śródlądowych: w razie konieczności, poszerzony obszar poza ustanowioną strefą kontroli.

I.5. Następstwa ustanowienia stref oraz wycofanie decyzji o ustanowieniu stref

I.5.1. Właściwy organ Państwa Członkowskiego zobowiązany jest zapewnić, aby wszystkie gospodarstwa znajdujące się w strefie kontroli, po ich opróżnieniu, zostały poddane przez odpowiedni okres czasu odłogowaniu oraz, w miarę potrzeb, dezynfekcji. Okres odłogowania w gospodarstwach zakażonych ISA nie może wynosić mniej niż sześć miesięcy. Długość okresu odłogowania w innych gospodarstwach znajdujących się w strefach kontroli ustalana jest przez właściwy organ, na podstawie jednostkowej oceny ryzyka. Po opróżnieniu wszystkich gospodarstw stosuje się przynajmniej sześciotygodniowy okres zsynchronizowanego odłogowania.

Ponadto, właściwy organ może podjąć decyzję o odłogowaniu gospodarstw znajdujących się w okręgach zagrożonych.

I.5.2. Decyzja o ustanowieniu stref kontroli nie może zostać odwołana, a strefy te nie mogą zostać na nowo zarybione do czasu opróżnienia z ryb wszystkich gospodarstw znajdujących się w tych strefach, dezynfekcji, w razie konieczności, oraz odłogowania zgodnie z częścią I.5.1. Przy ponownym zarybianiu stref, strefy kontroli przekształca się w okręgi zagrożone ustanowione w części I.4.4.3.

I.5.3. Decyzja o ustanowieniu tymczasowej strefy kontroli nie może zostać odwołana do chwili wyeliminowania podejrzenia o występowanie ISA, zgodnie z częścią I.2.2. W przypadku potwierdzenia ISA zgodnie z częścią I.3, tymczasowa strefa kontroli zostaje przekształcona w strefę kontroli.

I.5.4. Decyzja o ustanowieniu okręgów zagrożonych nie może zostać odwołana do czasu upływu dwóch lat od odwołania strefy kontroli.

I.6. Urzędowy nadzór w następstwie podejrzenia lub potwierdzenia ISA

I.6.1. W nawiązaniu do art. 5 ust. 2 i art. 6 dyrektywy 93/53/EWG oraz w celu ustalenia rozmieszczenia i rozwoju choroby w następstwie podejrzenia lub potwierdzenia występowania ISA w gospodarstwie, konieczna jest realizacja urzędowego programu nadzoru koncentrującego się na obszarach ryzyka, realizowanego przez właściwy organ lub przez wykwalifikowane służby ds. zdrowia ryb, w porozumieniu i pod nadzorem właściwego organu, we wszystkich gospodarstwach znajdujących się w ustanowionych strefach.

I.6.2. Do celów zastosowania takiego urzędowego programu nadzoru, właściwy organ musi, w razie konieczności – poprzez kontrole na miejscu, zidentyfikować wszystkie gospodarstwa w ustanowionych strefach oraz dokonać spisu gatunków, kategorii i ilości ryb w gospodarstwach, łącznie z danymi dotyczącymi śmiertelności.

I.6.3. Po wstępnym urzędowym spisie, gospodarstwa w ustanowionych tymczasowo strefach kontroli, w których znajduje się łosoś atlantycki (łosoś szlachetny) lub inne gatunki określone w ostatnim wydaniu Kodeksu zdrowia zwierząt wodnych OIE, należące do gatunków wrażliwych albo będących potencjalnymi nosicielami ISA, zobowiązane są przedkładać co 14 dni właściwemu organowi sprawozdania dotyczące śmiertelności. Zwiększoną śmiertelność zgłasza się w podziale na dni i kosze. W przypadku znacznego wzrostu śmiertelności w gospodarstwie, właściwy organ prowadzi dochodzenie.

W razie potwierdzenia podejrzeń, wszystkie gospodarstwa znajdujące się w ustanowionej strefie kontroli zobowiązane są przedkładać właściwemu organowi cotygodniowe sprawozdania dotyczące śmiertelności, w podziale na dni i kosze.

Gospodarstwa w obszarach zagrożonych przedkładają właściwemu organowi sprawozdania dotyczące śmiertelności co 14 dni.

Ponadto, inspekcje w ustanowionych strefach przeprowadza się regularnie w ciągu roku, z częstotliwością określoną w tabeli 1. Niemniej jednak, kiedy warunki klimatyczne uniemożliwiają przeprowadzenie takich inspekcji w niektórych porach roku, Państwa Członkowskie mogą ustanowić inną częstotliwość inspekcji, w ramach planu awaryjnego.

Tabela 1

Urzędowy program nadzoru

Program nadzoru realizuje się do chwili odwołania decyzji o ustanowieniu stref.

I.6.4. Inspekcje, dobór, pobieranie, przygotowanie i wysyłkę próbek przeprowadza się zgodnie z częściami II.1-II.4. Badania próbek dokonuje się zgodnie z częściami III-VI.

II. Inspekcja i pobieranie próbek

II.1. Inspekcja, dobór i pobieranie próbek w gospodarstwie podejrzewanym o występowanie ISA

II.1.1. Przy okazji regularnych inspekcji przeprowadzanych w ramach urzędowego programu nadzoru, o którym mowa w części I.6, oraz w gospodarstwach podejrzewanych o zakażenie ISA, wszystkie urządzenia i pomieszczenia (kosze, zbiorniki lub stawy) kontroluje się pod względem obecności ryb śniętych, słabych lub zachowujących się w sposób anormalny. W miarę możliwości, ostatnie przypadki śmiertelne (ryby, które nie uległy rozkładowi) oraz ryby słabe i zachowujące się w sposób anormalny, bada się pod kątem objawów klinicznych lub wyników badań pośmiertnych w odniesieniu do ISA, opisanych w bieżącym wydaniu Podręcznika diagnozowania chorób zwierząt wodnych Międzynarodowego Biura Epizootii (OIE).

II.1.2. W przypadku zaobserwowania objawów klinicznych wskazujących na ISA lub w przypadku, gdy inspektor albo lekarz weterynarii mają inne powody, aby podejrzewać zakażenie ryb, pobiera się próbkę składającą się minimum z 10 ryb. W miarę możliwości, próbka składa się z ryb śniętych i słabych lub zachowujących się w sposób anormalny. W przypadku występowania niewystarczającej ilości ryb z objawami klinicznymi, ilość ryb w próbce należy uzupełnić rybami zdrowymi, dobranymi z koszy, zbiorników lub stawów, charakteryzujących się największym odsetkiem ryb śniętych albo ryb z klinicznymi objawami choroby.

II.1.3. W przypadku zaobserwowania ryb śniętych, słabych lub zachowujących się w sposób anormalny, lecz niewykazujących klicznicznych objawów choroby, gdy wyniki badań pośmiertnych nie odpowiadają ISA, pobieranie próbek jest nieobowiązkowe, aczkolwiek mogą zostać pobrane próbki wymagane do przeprowadzenia diagnozy różnicowej, według uznania inspektora lub lekarza weterynarii.

II.1.4. W przypadku podejrzenia o zakażenie ISA ryb żyjących w środowisku naturalnym, Państwa Członkowskie zobowiązane są zapewnić pobranie odpowiednich próbek i ich zbadanie za pomocą właściwych metod klinicznych i laboratoryjnych ustanowionych w częściach II–VI, w celu wykluczenia lub potwierdzenia występowania ISA oraz celem dokonania oceny, czy choroba zagraża w znacznym stopniu rybom hodowlanym.

II.2. Przygotowanie próbek z ryb

II.2.1. Próbki do badania histologicznego pobiera się wyłącznie od ryb świeżo śniętych, wykazujących kliniczne objawy choroby lub od ryb, u których badania pośmiertne wskazują na występowanie choroby. Pobiera się próbki z miejsc objętych zmianami zewnętrznymi lub wewnętrznymi, a wątrobę, śródnercze, serce i śledzionę trzeba zawsze z każdej ryby usunąć za pomocą skalpela i umieścić w 8–10% roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. W celu odpowiedniego zakonserwowania tkanek, stosunek utrwalacza do tkanki musi wynosić przynajmniej 20:1.

II.2.2. Tkanki do badań wirusologicznych pobiera się od wszystkich ryb w ramach próbki. Do celów potwierdzenia pobiera się próbki podwójne. Części wątroby, przedniej części nerek, serca i śledziony usuwa się z ryby za pomocą sterylnego narzędzia i umieszcza się je w plastikowych probówkach zawierających 9 ml roztworu transportowego, t.j. podłoża hodowli komórkowych z antybiotykami. Zaleca się stosowanie mieszanki 12,5 µg amfoterycyny na mililitr^-1, 200 j.m. polimyksyny B na mililitr^-1 oraz 200 µg kanamycyny na mililitr^-1, ale można również zastosować inne mieszanki o udowodnionej skuteczności. Tkanki pobrane od maksymalnie 5 ryb można zgromadzić w jednej probówce zawierającej roztwór transportowy i mogą stanowić one jedną próbkę reprezentatywną. Masa tkanki w próbce powinna wynosić 1,0 ą 0,5 g.

II.2.3. Odciski nerek do badania techniką IFAT pobiera się jedynie od ryb świeżo śniętych, tj. w ciągu dwóch godzin od śmierci. Za pomocą sterylnych narzędzi usuwa się część śródnercza ryby. Tkankę osusza się na papierze absorpcyjnym celem usunięcia nadmiaru krwi, a następnie kilka razy odciska się ją na szklanym diapozytywie pokrytym poli-L-lizyną. Poszczególne odciski powinny do siebie przylegać tak, aby tworzyły ciągłą pojedynczą warstwę komórek, lecz nie mogą na siebie zachodzić. Krew ani płyn tkankowy nie są odpowiednim materiałem do tego testu. Należy unikać pozostawiania próbki z nerek na papierze absorpcyjnym celem „osuszenia”, gdyż może to skutkować krzepnięciem krwi i odkładaniem się na diapozytywie analitycznym dużej ilości białka surowiczego. Odciski osusza się na powietrzu, a następnie przechowuje się je w zimnym i suchym środowisku, jeżeli nie poddaje się ich niezwłocznie utrwaleniu. Utrwalanie odcisków przeprowadza się w ciągu 72 godzin od pobrania próbki od ryby. Alternatywnie, po wysuszeniu na powietrzu, odciski można zamrozić i przed wiązaniem przechowywać je przez okres nieprzekraczający jednego miesiąca w temperaturze - 20 °C.

II.2.4. Ryby z objawami niedokrwistości można ogłuszyć, a heparynizowane próbki krwi można niezwłocznie pobrać do badania hematologicznego, takiego jak pomiar hematokrytu.

II.2.5. Tkankę do analizy RT-PCR pobiera się od wszystkich ryb w ramach próbki. Kawałek przedniej nerki lub śródnercza usuwa się za pomocą sterylnego narzędzia i umieszcza się w probówce do mikromiareczkowania zawierającej 1 ml roztworu konserwującego RNA o udowodnionej skuteczności. Tkanki od maksymalnie pięciu ryb można zgromadzić w jednej probówce z roztworem konserwującym i mogą one stanowić jedną próbkę. Masa tkanki w próbce powinna wynosić średnio 0,5 g. W przypadku, gdy ryba jest za mała, aby otrzymać próbkę o wymaganej masie, można pobrać w kolejności kawałki nerki, serca, śledziony, wątroby lub odźwiernika jelita ślepego i utworzyć w ten sposób próbkę o masie 0,5 g.

II.3. Wysyłka próbek ryb

II.3.1. Próbki krwi oraz probówki z tkankami ryb do badania wirusologicznego lub analizy RT-PCR umieszcza się w izolowanych pojemnikach (na przykład w pudełkach wykładanych grubą warstwą polistyrenu), wraz z wystarczającą ilością lodu albo zamrożonych „chłodzących bloków”, aby zapewnić chłodzenie próbek podczas ich przewozu do laboratorium. Należy unikać zamrożenia, a lód powinien znajdować się w pudełku transportowym do momentu odbioru albo jeden lub kilka „bloków chłodzących” musi pozostawać w stanie częściowo bądź całkowicie zamrożonym. W wyjątkowych okolicznościach, próbki do analizy RT-PCR oraz próbki do badania wirusologicznego mogą zostać szybko zamrożone i przewiezione do laboratorium w temperaturze - 20 °C lub niższej.

II.3.2. Diapozytywy do analizy IFAT przesyła się w specjalnych uchwytach do diapozytywów, z wystarczającą ilością środka osuszającego, aby odciski pozostawały w stanie suchym i schłodzonym, tak jak powyżej.

II.3.3. Jeżeli tkanki ryb są przewożone do badania histologicznego w utrwalaczu, należy je umieścić w szczelnych probówkach, które następnie umieszcza się w pojemnikach odpornych na wstrząsy, takich jak pudełka wykładane grubą warstwą polistyrenu.

II.3.4. Jeżeli próbek nie poddaje się zamrożeniu, badanie wirusologiczne musi zostać przeprowadzone w możliwie jak najkrótszym czasie i nie później niż 72 godziny po pobraniu próbek. Próbkę do analizy potwierdzającej przechowuje się do momentu jej dotarcia do laboratorium w temperaturze - 20 °C lub niższej.

II.3.5. Cała ryba może być przesłana do laboratorium, jeżeli podczas przewozu można zapewnić wymaganą temperaturę określoną w części II.3.1. Rybę w całości zawija się w papier abrosrpcyjny i przesyła się ją w plastikowej torbie, w stanie schłodzonym, tak jak powyżej.

II.3.6. Przewozić można również ryby żywe, lecz pod nadzorem urzędowych służb.

II.3.7. Do analizy RT-PCR, tkanek konserwowanych w RNA, ekstrakcji RNA dla próbek przechowywanych w różnych temperaturach dokonuje się w określonym czasie. Czas ten wynosi:

- 37 °C jeden dzień

- 25 °C tydzień

- 4 °C miesiąc

- - 20 °C nieokreślony

II.3.8. Wszystkie opakowania i etykiety muszą zostać wykonane zgodnie z obowiązującymi przepisami w zakresie transportu krajowego i międzynarodowego, w zależności od potrzeb.

II.4. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

W porozumieniu z laboratoriami diagnostycznymi, do celów wykonania badań uzupełniających można pobrać i przygotować inne tkanki ryb.

III. Badanie wirusologiczne

III.1. Przygotowanie próbek

III.1.1. W przypadku pojawienia się praktycznych trudności uniemożliwiających inokulację komórek w ciągu 72 godzin od pobrania próbek tkanek, dopuszcza się zamrożenie tkanki w temperaturze - 80 °C na maksymalnie 28 dni. Tkanka przed badaniem może być zamrożona i rozmrożona tylko raz.

III.1.2. Każda próbka (tkanka w roztworze transportowym) musi zostać poddana całkowicie homogenizacji za pomoca stomachera, mieszarki lub przy pomocy moździerza, odwirowana z prędkością 2 000-4 000 obrotów x g przez 15 minut i w temperaturze 0-6 °C, a ciecz sklarowaną nad osadem należy przefiltrować przez filtr 0,45 µm i inkubować odpowiednią ilością prawidłowo rozcieńczonej surowicy odpornościowej do miejscowych serotypów IPNV. Miano surowicy odpornościowej musi wynosić co najmniej 1:2000 w przypadku testu neutralizacji na płytkach 50%. Mieszankę inkubuje się przez godzinę w temperaturze 15 °C. W ten sposób otrzymuje się materiał inokulacyjny.

Poddawanie wszystkich inokulów działaniu surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała swoiste wobec wirusa IPN (wirusa, który w kilku częściach Europy występuje w 50% próbek ryb) ma na celu zapobieganie CPE wywołanemu wirusem IPN rozwijającemu się w inokulowanych hodowlach komórkowych. Dzięki takiemu postępowaniu skraca się czas badania wirusologicznego, jak również liczbę przypadków, w których występowanie CPE musiałoby zostać uznane jako potencjalnie wskazujące na obecność ISAV.

W przypadku próbek pochodzących z jednostek produkcyjnych, które są uznane za wolne od IPN, nie jest konieczne poddawanie zaszczepionych hodowli komórkowych działaniu surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała swoiste wobec wirusa IPN.

III.2. Inokulacja hodowli komórkowych

III.2.1. Komórki SHK-1 (przelot 80 lub niższy) lub komórki TO wzrastają na podłożu L-15 zwierającym 5% płodową surowicę bydlęcą, 2% (v/v) 200 mM L-glutaminę oraz 0,08% (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanolu na płytkach 12- lub 24-basenikowych. Można użyć innych linii komórkowych o udowodnionej skuteczności i czułości, z uwzględnieniem zmienności szczepu oraz zdolności różnych szczepów do replikacji w różnych liniach komórkowych. Zawiesinę organów poddaną działaniu surowicy odpornościowej inokuluje się do młodych hodowli komórkowych o szybkim wzroście, aby materiał tkankowy rozpuścić ostatecznie do bakteryjnej pożywki hodowlanej w stosunku 1:1000. Dla każdej zawiesiny organów dodaje się 40 µl inokulum, do jednego basenika zawierającego 2 ml bakteryjnej pożywki hodowlanej. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, zaleca się stosowanie oddzielnych płytek 12- lub 24-basenikowych dla próbek z różnych gospodarstw rybackich.

III.2.2. Jednej płytki nie poddaje się inokulacji i służy ona jako kontrola ujemna. Oddzielną płytkę inokuluje się izolatem referencyjnym ISAV i służy ona jako kontrola dodatnia. Operację tę wykonuje się w następujący sposób. 100 µl preparatu wyjściowego ISAV (minimalne miano roztworu 10⁷ TCID50 ml^-1) inokuluje się do pierwszego basenika, po czym zawartość należy dobrze wymieszać. Całą objętość materiału należy przenieść z pierwszego basenika do drugiego i rozcieńczyć w stosunku 1:10 oraz dokładnie wymieszać. Czynność tę należy powtórzyć na całej płytce tak, aby utworzyć sześć 10-krotnych rozcieńczeń. Zapas ISAV można przechowywać w temperaturze - 80 °C przez co najmniej dwa lata, lecz po rozmrożeniu należy go zużyć w ciągu trzech dni. Uwaga: należy uważać, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu płytek analitycznych materiałem kontroli dodatniej. Aby uniknąć takiego niebezpieczeństwa, kontrole dodatnie należy umieścić i obchodzić się z nimi z dala od płytek analitycznych.

III.2.3. Próbki inkubuje się w temperaturze 14 ą 2 °C przez okres do 15 dni.

III.3. Badanie mikroskopowe

Hodowle komórkowe sprawdza się pod kątem wystąpienia CPE dwukrotnie, między piątym a siódmym oraz między 12 a 14 dniem od inakulacji. Jeżeli którykolwiek wynik wskaże na występowanie CPE, należy niezwłocznie wszcząć procedury identyfikacyjne (III.6). Jeżeli do 14 dnia CPE nie zostanie zaobserwowane, wykonuje się test hemadsorpcji (III.4).

III.4. Hemadsorpcja

Replikacja ISAV w hodowlach komórkowych nie zawsze skutkuje CPE. Dlatego też, każdy basenik należy poddać opisanemu poniżej testowi hemadsorpcji, lub alternatywnie, każdy basenik poddaje się testowi IF opisanemu w części III.6.1.

III.4.1. Z każdego basenika należy usunąć podłoże hodowli komórkowej, łącznie z tymi z kontrolą dodatnią i ujemną, a następnie umieścić w sterylnych probówkach, opatrzonych etykietami. Do każdego basenika dodaje się pięćset µl 0,2% (v/v) zawiesiny wypłukanych czerwonych krwinek pstrąga kalifornijskiego lub łososia atlantyckiego i inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Czerwone krwinki usuwa się, a każdy basenik przepłukuje się dwukrotnie czynnikiem L-15. Każdy basenik poddaje się badaniu mikroskopowemu.

III.4.2. Występowanie skupisk czerwonych krwinek, przylegających do powierzchni komórek SHK-1 lub TO wskazuje na przypuszczalne zakażenie ortomiksowirusem. Jeżeli wynik testu hemadsorpcji jest pozytywny, należy niezwłocznie wykonać test identyfikacyjny wirusa (III.6).

III.5. Subkultywacja podrzędna lub pasażowanie

III.5.1. Subkultywacji dokonuje się między 13 a 15 dniem. Dwieście dwadzieścia pięć µl supernatantu hodowli dodaje się do baseników ze świeżymi i aktywnie wzrastającymi komórkami SHK-1 na 12-basenikowych płytkach i inkubuje się w temperaturze 14 ą 2 °C przez okres do 18 dni. Hodowle komórkowe sprawdza się pod kątem wystąpienia CPE dwukrotnie, między piątym a siódmym oraz między 14 a 18 dniem od inakulacji, za pomocą mikroskopu. Jeżeli którykolwiek wynik wskaże na występowanie CPE, należy niezwłocznie wszcząć procedury identyfikacyjne (III.6). Jeżeli do 14 - 18 dnia CPE nie zostanie zaobserwowane, wykonuje się test hemadsorpcji (III.4).

III.5.2. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności w ciągu siedmiu dni od inkubacji, subkultywacji dokonuje się na tym etapie, a komórki trzeba inkubować przez 14 do 18 dni i ponownie subkultywować za pomocą inkubacji między kolejnym 14 a 18 dniem. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności po siedmiu dniach, subkultywację przeprowadza się raz, a komórki inkubuje się tak, aby całkowity okres inkubacji wynosił 28-36 dni od pierwotnej inokulacji.

III.5.3. W przypadku wystąpienia w hodowli pierwotnej skażenia bakteryjnego, test należy powtórzyć, z zastosowaniem homogenatu tkanki przechowywanego w temperaturze - 80 °C. Przed inokulacją, homogenat tkanki odwirowuje się z prędkością 2 000 do 4 000 obrotów x g przez 30 minut i w temperaturze 0-6 °C, a supernatant filtruje się przez filtr 0,22 µm. Jeżeli skażenie bakteryjne wystąpi na etapie subkultywacji, supernatant filtruje się przez filtr 0,22 µm, następnie inokuluje się na świeże komórki i inkubuje przez kolejne 14 do 18 dni.

III.6. Testy identyfikacyjne wirusa

W przypadku zaobserwowania oznak CPE na jakimkolwiek etapie lub w przypadku pozytywnego wyniku testu hemadsorpcji, należy dokonać identyfikacji wirusa. Istnieje możliwość doboru metody identyfikacji ISAV, czyli IF (III.6.1) i RT-PCR (część IV). W przypadku stwierdzenia możliwości występowania innych wirusów, zaleca się przeprowadzenie uzupełniających testów na identyfikację wirusa. Jeżeli testy te nie pozwalają na ostateczne zidentyfikowanie wirusa w ciągu jednego tygodnia, supernatant należy przesłać do krajowego laboratorium referencyjnego, bądź do laboratorium referencyjnego UE właściwego dla chorób ryb w celu natychmiastowej identyfikacji.

III.6.1. IF

III.6.1.1. Komórki SHK-1 (przelot 80 lub niższy) lub komórki TO wzrastają na podłożu L-15 zwierającym 5% płodową surowicę bydlęcą, 2% (v/v) 200 mM L-glutaminę oraz 0,08% (v/v) 50 mM 2-merkaptoetanolu na płytkach 24- lub 96-basenikowych, przy 50% lub wyższej konfluencji. Można użyć innych linii komórkowych o udowodnionej skuteczności i czułości. Do każdego basenika dodaje się dwieście dwadzieścia pięć µl próbnego supernatantu hodowli zakażonego wirusem, miesza się i 225 µl przenosi się do dwóch kolejnych baseników, co daje rozcieńczenie w stosunku 1:5. Dwa dodatkowe baseniki pozostawia się bez inokulowania i służą one jako kontrole. Próbki z każdego gospodarstwa rybackiego powinny znajdować się na oddzielnych płytkach, tak samo jak kontrola wirusa. Kontrolę wirusa zakłada się za pomocą izolatu ISAV.

III.6.1.2. Płytki inkubuje się w temperaturze 14 ą 2 °C i bada się pod mikroskopem przez okres do siedmiu dni. W przypadku zaobserwowania wczesnego CPE lub niezaobserwowania CPE w ciągu siedmiu dni, kolejnym krokiem powinno być utrwalanie. Baseniki przepłukuje się PBS i utrwala za pomocą inkubacji 80% acetonem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Płytki suszy się na powietrzu i niezwłocznie zabarwia lub przechowuje się je w temperaturze 0-6 °C przez nie więcej niż 24 godziny przed zabarwieniem.

III.6.1.3. Replikowane baseniki zabarwia się przeciwciałem monoklonalnym 3H6F8 do ISAV, lub innym przeciwciałem monoklonalnym o udowodnionej skuteczności i swoistości, rozcieńczonym w PBS i inkubowanym w temperaturze
37 ą 4 °C przez 30 minut. Monoklonalne przeciwciało usuwa się, a płytki przemywa się trzykrotnie 0,05% Tween 20 w PBS. Do każdego basenika dodaje się antymysi koniugat IgG FITC rozcieńczony w PBS i inkubuje się w temperaturze
37 ą 4 °C przez 30 minut. Uwaga: rozcieńczenia różnych partii przeciwciał monoklinalnych i koniugatu FITC optymalizuje się w każdym laboratorium. Przeciwciało usuwa się, a płytki przemywa się trzykrotnie 0,05% Tween 20 w PBS.

III.6.1.4. Baseniki niezwłocznie poddaje się badaniu przy pomocy mikroskopu inwersyjnego, nastawionego na fluorescencyjne badanie mikroskopowe z zastosowaniem odpowiedniego filtra do wzbudzania FITC. Wynik testu uważa się za pozytywny w przypadku zaobserwowania komórek fluorescencyjnych. Dla ważności testu, kontrole dodatnie muszą dać wynik pozytywny, a kontrole ujemne – wynik negatywny.

IV. Badanie próbek za pomocą RT-PCR

IV.1. Niniejsza sekcja opisuje procedury obowiązujące do wzmocnienia PCR części segmentu 8 genomu ISAV, które może zostać przeprowadzone na tkance ryby lub na ISAV w hodowli

IV.1.1. Ekstrahowanie RNA

a) Z każdej próbki należy usunąć RNA. Do każdej probówki dodaje się 1 ml dH2O poddanej działaniu DEPC i odwirowuje się z prędkością 13 000 obrotów na minutę przez pięć minut, w temperaturze 0-6 °C.

b) Z każdej próbki należy usunąć supernatant oraz dodać do każdej próbki i probówki kontrolnej zawierającej odpowiedni materiał kontroli (400 µl dH2O lub homogenat nerkowy z ryby pozbawionej patogenu 800 µl TRIzolu (Invitrogen) lub alternatywnego odczynnika o udowodnionej równoważnej albo większej skuteczności. W razie konieczności, tkanki należy porozrywać za pomocą pipety. Probówki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Do każdej probówki dodaje się 160 µl chloroformu, po czym energicznie należy wstrząsać probówkami przez trzy minuty, a następnie odwirowywać w prędkością 13 000 obrotów na minutę w temperaturze 0-6 °C.

c) Górną wodną warstwę usuwa się do opatrzonej etykietą 1,5 ml mikroprobówki zawierającej 500 µl izopropanolu i probówki inkubuje się przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywuje się z prędkością 6 500 obrotów na minutę, przez 15 minut i w temperaturze 0-6 °C.

d) Supernatant usuwa się, a do pigułki RNA dodaje się 1 ml 75% etanolu. Następnie probówki odwirowywuje się z prędkością 6 500 obrotów na minutę, przez pięć minut i w temperaturze 0-6 °C.

e) Supernatant usuwa się, a probówki pozostawia się otwarte na około trzy minuty, celem wyparowania pozostałego etanolu. Dodaje 15 µl dH2O poddanej działaniu DEPC, w celu powtórnego utworzenia zawiesiny z tabletki, krótko wirując, w razie konieczności.

f) Do obliczenia stężenia RNA oraz czystości próbek używa się spektrofotometru. Pomiaru gęstości optycznej dokonuje się przy 260 i 280 nm.

g) RNA stosowany niezwłocznie (tego samego dnia) można tymczasowo przechowywać w temperaturze 0-6 °C. W innych przypadkach, RNA przechowuje się w temperaturze – 80 °C.

IV.1.2. RT

a) Dwie µg RNA rozcieńcza się w dH2O poddanej działaniu DEPC w 1,5 ml mikroprobówkach. W przypadku, gdy stężenie RNA w próbce jest za niskie dla zastosowania 2 µg w reakcji RT, należy zastosować maksymalną dopuszczalną ilość RNA. Rozcieńczone RNA inkubuje się w temperaturze 55-60 °C przez 10 minut.

b) Następnie probówki z RNA umieszcza się na podłożu z lodu oraz dodaje się odczynniki RT, dla uzyskania końcowych stężeń 1 × roztworu buforowego, 1mM dNTP, 100 ng heksametrów losowych, 20 U inhibitora RNase oraz 200 U MMLV-RT, przy całkowitej objętości 20 µl.

c) Probówki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez godzinę.

d) cDNA przechowuje się w temperaturze 0-6 °C przez wymagany okres czasu i możliwie jak najszybciej należy wykorzystać go do PCR.

IV.1.3. PCR

a) Pięć µl cDNA dodaje się do 45 µl mieszanki PCR, dla uzyskania końcowych stężeń 1 × roztworu buforowego, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM każdego dNTP, 25 pmol każdego podkładu i 1U polimerazy Taq. Podkładami są ISA+ (5'-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3') (podkład przewodzący) oraz ISA- (5'-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3') (podkład odwrotny). Należy dodać kontrole ujemne dla ekstrakcji, RT i PCR.

b) Probówki umieszcza się w termocyklerze zaprogramowanym na 94 °C na pięć minut, przy czym najpierw na 35 cykli w temperaturze 94 °C na jedną minutę, na jedną minutę w temperaturze 55 °C oraz na jedną minutę w temperaturze 72 °C, przy końcowej inkubacji w temperaturze 72 °C na pięć minut.

c) Wyniki PCR ocenia się po elektroforezie, z zastosowaniem 2% żelu agarowego, zabarwinego bromkiem etydu oraz ze znacznikami rozmiaru wzdłuż próbek i prób ujemnych z RT i PCR. Jeden produkt PCR 15 5bp uważa się za wskazujący na obecność ISAV RNA. Próbki zawierające jeden dodatkowy produkt 310bp również uważa się za zawierające ISAV RNA. Próbki dające wielokrotność produktów PCR, w tym przynajmniej jeden o średniej wartości 155 bp, mogą zawierać ISAV RNA. Można to sprawdzić za pomocą sond DNA lub sekwencjonowania nukleotydów.

IV.1.4. Potwierdzenie PCR izolacji ISAV w hodowli tkanek

W przypadku wystąpienia całkowitego CPE podczas badania wirusologicznego próbek tkanek w komórkach SHK-1, z basenika należy usunąć 400 µl supernatantu i umieścić go w 1,5 ml sterylnej probówce. Z próbki tej należy wyekstrahować RNA w sposób przedstawiony w części III.1 i przeprowadzić RT-PCR. W przypadku zastosowania hodowli bez całkowitego CPE, supernatant należy usunąć, a komórki należy zgarnąć z powierzchni basenika i umieścić w sterylnej 1,5 ml probówce do ekstrakcji RNA oraz RT-PCR.

IV.1.5. Potwierdzenie produktów PCR za pomocą sondy DNA

a) Specyficzność produktu PCR 155 bp można ocenić za pomocą sondy PCR, wykonanej za pomocą oligonukleotydu hybrydyzującego okolice produktu PCR wewnątrz warstwy podkładowej. Produkty PCR poddaje się elektroforezie w 1% żelu agarowym, wzdłuż znaczników rozmiaru wzdłuż i kontroli dodatniej oraz kontroli ujemnych z RT i PCR.

b) DNA przenosi się na przeponę, a oznaczony oligonukletoid (5'-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3') inkubuje się z przeponą po wykonaniu wstępnej hybrydyzacji.

c) Niezwiązane oraz niezwiązane specyficznie sondy zmywa się z przepony oraz dokonuje się oceny wizualnej sond związanych.

d) Sondy związane fragmentarycznie z 155 bp (oraz 310 bp, jeżeli występuje) stanowią dowód na specyficzność PCR, co wskazuje na obecność ISAV RNA w próbce.

IV.1.6. Badanie sekwencji nukleozydów produktów PCR

Specyficzność PCR można ocenić poprzez badanie sekwencji nukleozydów produktu PCR 155 bp.

a) Produkt PCR należy oczyścić z żelu agarowego lub roztworu.

b) Fragment sekwencjonuje się z zastosowaniem tych samych warstw podkładowych, które stosowano w PCR lub wektorowych warstw podkładowych, jeżeli zostały sklonowane do wektora przed sekwencjonowaniem.

c) Sekwencję nukleozydów można porównać z sekwencjami segmentu 8 dla ISAV, dostępnymi w bazie danych sekwencji nukleozydów EMBL (numery dostępu Y10 404, AJ012 285, AJ242016).

d) Występowanie sekwencji odpowiadającej sekwencji segmentu 8 ISAV dowodzi, że próbka zawierała ISAV RNA.

V. Badanie odcisków nerek za pomocą IFAT

V.1. Dla badania odcisków nerek za pomocą IFAT przyjęto następujący protokół

V.2. Przygotowanie i barwienie odcisków

V.2.1. Diapozytywy umieszcza się w acetonie lub w mieszance metanolu i acetonu (1:1) na trzy minuty i suszy się na powietrzu. Prze zabarwieniem, każdy diapozytyw należy zbadać, a właściwe jego obszary należy zakreślić pisakiem ImmEdge^TM lub podobnym pisakiem i pozostawić do wysuszenia na powietrzu. Następnie, diapozytywy umieszcza się w roztworze blokującym (6% mleko odtłuszczone w PBS zawierającym 0,2% Tween 20) i inkubuje się lekko mieszając, przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Każdy diapozytyw należy wysuszyć i umieścić w pozycji poziomej w skrzynce na diapozytywy, wyłożonym wilgotną bibułką, celem utrzymania wilgotności.

V.2.2. Każdy odcisk pokrywa się roztworem przeciwciała monoklonalnego 3H6F8 do ISAV (lub innego przeciwciała o udowodnionej swoistości i skuteczności), a skrzynkę na diapozytywy zamyka się i inkubuje wstrząsając, przez 60 minut i w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj przeciwciało rozcieńcza się w stosunku 1:10 do 1:100 w 1% mleku odtłuszczonym, lecz faktyczne rozcieńczenie trzeba określić dla każdej partii. Diapozytywy myje się trzykrotnie przez dwie minuty w PBS zawierającym 0,1% Tween 20. Każdy odcisk pokrywa się roztworem zawierającym antymysi koniugat kozi FILC, rozcieńczony w stosunku 1:1000 w 1% mleku odtłuszczonym i inkubuje się w wilgotnym środowisku przez 60 minut, w temperaturze pokojowej. Diapozytywy myje się trzykrotnie przez dwie minuty w PBS zawierającym 0,1% Tween 20. Każdy diapozytyw pokrywa się roztworem CITIFLUORTM (500 ul CITIFLUORTMU z 1,5 ml 0,1% (v/v) Tween 20 w PBS) lub innym odpowiednim czynnikiem, na 10 minut. Diapozytywy myje się trzykrotnie w PBS zawierającym 0,1% Tween 20. W przypadku, gdy wymagany jest odplamiacz, każdy odcisk można pokryć jodkiem propidionu (0,01 mg/ml) w PBS zawierającym 0,1% Tween 20 i inkubować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Diapozytywy myje się trzykrotnie przez dwie minuty w PBS zawierającym 0,1% Tween 20. Diapozytywy osusza się i osadza w CITIFLUOR^TM lub innym odpowiednim czynniku montującym. Przed badaniem mikroskopowym, diapozytywy przechowuje się w ciemności, w temperaturze 4 °C.

V.3. Fluoroscencyjne badanie mikroskopowe

Każdy diapozytyw bada się pod mikroskopem odpowiednim do podświetlenia epifluorescencyjnego, z zastosowaniem odpowiedniego filtra, który wzbudzi FITC, skutkując emisją charakterystycznego zielonego zabarwienia fluorescencyjnego. Wszystkie pola w obszarach zakreślonych pisakiem ImmEdgeTM bada się pod obiektywem o dziesięciokrotnym i dwudziestokrotnym powiększeniu, a obszary podejrzane (z zielonym zabarwieniem fluorescencyjnym) bada się następnie obiektywem o 40-krotnym powiększeniu i przy oświetleniu fazowym / fluorescencyjnym, dla zapewnienia skojarzenia zabarwienia fluorescencyjnego z komórką. Współrzędne danego stadium dla podejrzanych obszarów należy odnotować, celem późniejszego potwierdzenia charakteru zabarwienia fluorescencyjnego przez drugiego analityka. Po wstępnym badaniu, diapozytywy dodatnie lubb podejrzane należy poddać ponownemu badaniu przez drugiego analityka, a wyniki potwierdzić.

V.4. Kontrole

V.4.1. Każda partia diapozytywów zabarwionych pod kątem IFAT musi obejmować trzy rodzaje kontroli:

- odcisk nerek z niezakażonego łososia atlantyckiego (kontrola ujemna),

- niezakażona hodowla komórkowa SHK-1 lub inna podatna na zakażenie hodowla komórkowa (kontrola ujemna),

- hodowla komórkowa SHK-1 zakażona ISAV lub inna podatna na zakażenie hodowla komórkowa (kontrola dodatnia).

V.4.2. W miarę możliwości, zaleca się dodatkową kontrolę dodatnią w postaci ocisku nerek łososia atlantyckiego zakażonego ISAV.

V.4.3. W przypadku uzyskania pozytywnego wyniku przy kontrolach ujemnych, test uważa się za nieważny w odniesieniu do wszystkich diapozytywów w danej partii. Jeżeli wszystkie diapozytywy w partii, łącznie z kontrolami ujemnymi, są negatywne, test uważa się za nieważny w odniesieniu do wszystkich diapozytywów w danej partii. W przypadku unieważnienia partii diapozytywów w wyniku błędu kontroli, diapozytywy takie należy zniszczyć oraz przeprowadzić ponowny test z zastosowaniem identycznych odcisków.

V.5. Badanie innych tkanek

Przedmiotową technikę można zastosować do innych tkanek ryb, takich jak wątroba, śledziona i serce, z zastrzeżeniem, że na diapozytywie może zostać umieszczona umiarkowana ilość komórek śródbłonka, leukocytów lub limfocytów. Procedura barwienia jest taka sama dla każdej tkanki, aczkolwiek w przypadku niektórych tkanek może być wskazane pominięcie barwienia jodkiem propidionu, polegające na podświetlaniu fazowym w celu identyfikacji rodzajów komórek obecnych w odcisku.

VI. HISTOLOGIA

Sekcje zalane parafiną można pociąć na 5 µm i zabarwić z zastosowaniem hematoksyliny i eozyny. Zmiany histologiczne związane z ISA opisane zostały w bieżącym wydaniu Podręcznika chorób zwierząt wodnych OIE.

VII. Akronimy i skróty