ZAŁĄCZNIK

OZNACZANIE LASALOCIDU - SOLI SODOWEJ

Sól sodowa polieteru kwasu monokarbokrylowego wytworzonego przez Streptomyces lasaliensis

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda służy oznaczaniu lasalocidu - soli sodowej w paszach i premiksach. Granica wykrywalności wynosi 5 mg/kg, granica oznaczania wynosi 30 mg/kg.

2. Zasada

Lasalocid - sól sodowa jest ekstrahowana z próbki do zakwaszonego metanolu i oznaczana przez odwrotną fazę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) poprzez użycie detektora spektrofluorymetrycznego.

3. Odczynniki

3.1. Diwodoro(orto)fosforan potasu (KH₂PO₄)

3.2. Kwas ortofosforowy, w = 85%

3.3. Roztwór kwasu ortofosforowego, σ = 20%

Rozcieńczyć 23,5 ml kwasu ortofosforowego (3.2) wodą do objętości100 ml.

3.4. 6-metylo-2-heptyloamina (1,5-dimetyloheksylamina), w = 99%

3.5. Metanol, klasa wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

3.6. Kwas solny, ρ₂₀ 1,19 g/ml

3.7. Roztwór buforowy fosforanu, c = 0,01 mol/l

Rozpuścić 1,36 g KH₂PO₄ (3.1) w 500 ml wody (3.11), dodać 3,5 ml kwasu ortofosforowego (3.2) i 10,0 ml 6-metyl-2-heptyloaminy (3.4). Doprowadzić odczyn pH do wartości 4,0 roztworem kwasu ortofosforowego (3.3) i rozcieńczyć wodą (3.11) do objętości 1 000 ml.

3.8. Zakwaszony metanol

Przenieść 5,0 ml kwasu solnego (3.6) do kolby miarowej o pojemności 1 000 ml, dopełnić do oznaczenia metanolem (3.5) i wymieszać. Roztwór ten należy sporządzać bezpośrednio przed użyciem.

3.9. Faza ruchoma HPLC, buforowy roztwór fosforanu i metanolu 5 + 95 (V + V)

Zmieszać 5 ml buforowego roztworu fosforanu (3.7) z 95 ml metanolu (3.5).

3.10. Podstawowa substancja lasalocidu - soli sodowej o gwarantowanej czystości, C₃₄H₅₃O₈Na (sól sodowa polieteru kwasu monokarboksylowego wytworzona przez streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1. Podstawowy roztwór mianowany lasalocidu - soli sodowej, 500 mg/ml

Odważyć 50 mg lasalocidu-soli sodowej z dokładnością do 0,1 mg (3.10), do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w zakwaszonym metanolu (3.8) dopełnić do oznaczenia tym samym rozpuszczalnikiem i wymieszać. Niniejszy roztwór należy sporządzać bezpośrednio przed użyciem.

3.10.2. Pośredni roztwór mianowany lasalocidu - soli sodowej, 50mg/ml

Pobrać pipetą 10,0 ml podstawowego roztworu mianowanego lasalocidu-soli sodowej (3.10.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dopełnić do oznaczenia zakwaszonym metanolem (3.8) i wymieszać. Niniejszy roztwór należy sporządzać bezpośrednio przed użyciem.

3.10.3. Roztwory wzorcowe

Do szeregu kolb wzorcowych o pojemności 50 ml przenieść 1.0, 2.0, 4,0 5,0 oraz 10,0 ml pośredniego roztworu mianowanego (3.10.2). Dopełnić do oznaczenia zakwaszonym metanolem (3.8) i wymieszać. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 1,0 2,0 4,0 5,0 i 10,0 mg lasalocidu-soli sodowej na ml. Roztwory te muszą być sporządzane bezpośrednio przed użyciem.

3.11. Woda, stopień HPLC

4. Aparatura

4.1. Łaźnia ultradźwiękowa (lub wstrząsana łaźnia wodna) z kontrolą temperatury

4.2. Filtry membranowe, 0,45 mm

4.3. Sprzęt do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z systemem wtryskowym, odpowiednim do wtryskiwania jednostek o pojemności 20 ml.

4.3.1. Płynna kolumna chromatograficzna, 125 mm x 4 mm, chromatografia podziałowa z odwróconą fazą C18 o wypełnieniu 5 μm lub równoważnym

4.3.2. Spektrofluorymetr z możliwością zmiany długości fal wzbudzenia i emisji

5. Procedura

5.1. Ogólne

5.1.1. Próba ślepa

Do celów przeprowadzenia testu odzysku (5.1.2) powinna zostać przeprowadzona analiza ślepej próby w celu upewnienia się, czy nie występuje w niej ani lasalocidu-sól sodowa ani substancje przeszkadzające. Próba ślepa powinna być podobna pod względem rodzaju do próbki i nie powinna zostać wykryta obecność lasalocidu soli sodowej ani substancji przeszkadzających.

5.1.2. Test odzysku

Test odzysku powinien być przeprowadzany przez analizę próby ślepej, która została wzmocniona przez dodanie określonej ilości lasalocidu-soli sodowej, podobnej do tej, która znajduje się w próbce. W celu wzmocnienia na poziomie 100 mg/kg, przekazać 10,0 ml roztworu mianowanego (3.10.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do około 0,5 ml. Dodać 50 g ślepej próby, starannie wymieszać i pozostawić na 10 minut, mieszając kilkakrotnie przed przejściem do etapu ekstrakcji (5.2).

Alternatywnie, jeśli nie jest dostępna próba ślepa podobna pod względem rodzaju nie do próbki (patrz: 5.1.10), test odzysku można przeprowadzić środkami metody dodawania wzorca. W tym przypadku, próbka, która ma zostać poddana analizie jest wzmacniana lasalocidem-solą sodową, w ilości podobnej do tej zawartej w próbce. Niniejsza próbka jest analizowana razem z próbką niewzmocnioną, a odzysk oblicza się przez odejmowanie.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Pasze

Odważyć z dokładnością do 0,01 g od 5 g do 10 g próbki, do w kolby stożkowej o pojemności 250 ml z korkiem. Dodać pipetą 100,0 ml zakwaszonego metanolu (3.8), zamknąć lekko korkiem i zawirować do rozproszenia. Umieścić kolbę w kąpieli ultradźwiękowej (4.1), w temperaturze około 40 °C, na 20 minut, wyciągnąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Odstawić na godzinę, do momentu osadzenia się zawiesiny, następnie przefiltrować podwielokrotną część próbki przez filtr membranowy 0,45 μm (4.2) do odpowiedniego naczynia. Następnie przejść do oznaczenia wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (5.3).

5.2.2. Premiksy

Odważyć z dokładnością do 0,001 g ok. 2 g premiksu, do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 100,0 ml zakwaszonego metanolu (3.8) i zawirować do rozproszenia. Umieścić kolbę wraz z jej zawartością w kąpieli ultradźwiękowej (4.1), w temperaturze około 40 °C, na 20 minut, wyciągnąć i schłodzić do temperatury pokojowej, Rozcieńczyć w zakwaszonym metanolu do oznaczenia (3.8) i dobrze wymieszać. Odstawić na godzinę, do momentu osadzenia się zawiesiny, następnie przefiltrować podwielokrotną część próbki przez filtr membranowy 0,45 μm (4.2). Rozcieńczyć odpowiednią ilość oczyszczonego filtratu zakwaszonym metanolem (3.8), aby uzyskać ostateczny roztwór analityczny, zawierający około 4 μm/ml lasalocidu-soli sodowej. Następnie przejść do oznaczenia wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (5.3).

5.3. Oznaczanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

5.3.1. Parametry

W celach orientacyjnych proponuje się zachowanie następujących warunków; można też stosować inne warunki, o ile dają one takie same wyniki:

Płynna kolumna chromatograficzna (4.3.1):	125 mm x 4 mm, odwrócona faza C18, 5 μm wypełnienia, lub równoważnik
Faza ruchoma (3.9):	Mieszanina roztworu buforowego fosforanu (3.7) i metanolu (3.5) 5 + 95 (V + V)
Szybkość przepływu:	1,2 ml/min
Detekcja długości fal:
- Wzbudzenie:	310 nm
- Emisja:	419 nm
Objętość wtrysku:	20 μl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, wtryskując w tym celu kilkakrotnie roztwór wzorcowy (3.10.3) zawierający 4,0 μg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości (lub powierzchni) pików i czasu retencji.

5.3.2. Krzywa wzorcowa

Wtryskiwać kilkakrotnie każdy roztwór wzorcowy (3.10.3) i oznaczyć średnie wysokości piku (powierzchnie) dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą wzorcową wykorzystując średnie wysokości (powierzchnie) pików roztworów wzorcowych jako rzędnych i odpowiadających im stężeń, w μg/ml, jako odciętych.

5.3.3. Roztwór próbny

Wtryskiwać kilkakrotnie ekstrakty uzyskane w 5.2.1 lub 5.2.2, wykorzystując taką samą objętość jak przyjętą dla roztworów wzorcowych i oznaczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) dla lasalocidu-soli sodowej.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie średnich wysokości piku (powierzchni), wytworzonych przez wtryśnięcie roztworu próbnego (5.3.3), określić stężenie lasalocidu-soli sodowej (μg/ml) przez porównanie z krzywą wzorcową.

6.1. Pasze

Zawartość lasalocidu soli sodowej, w (mg/kg), w próbce oblicza się przy pomocy następującego wzoru:

gdzie:

β = stężenie lasalocidu-soli sodowej w roztworze próbnym (5.2.1), w μg/ml

V₁ = objętość ekstraktu próbki zgodnie z 5.2.1 w ml (tj. 100)

m = masa porcji próbnej, w gramach

6.2. Premiksy

Zawartość lasalocidu-soli sodowej, w (mg/kg), w próbce oblicza się przy pomocy następującego wzoru:

gdzie:

β = stężenie lasalocidu-soli sodowej w roztworze próbnym (5.2.1), w μg/ml

V₂ = objętość ekstraktu próbki zgodnie z 5.2.2, w ml (tj. 250)

f = współczynnik rozcieńczenia, zgodnie z 5.2.2

m = masa porcji próbnej, w gramach

7. Ocena poprawności wyników

7.1. Tożsamość

Metody oparte o spektrofluorymetrię są mniej podatne na zakłócenia niż te, w których używa się detekcji promieni UV. Tożsamość analitu może być potwierdzona przez chromatografię równoległą.

7.1.1. Chromatografia równoległa

Do ekstraktu próbki (5.2.1 lub 5.2.2) dodaje się odpowiednią ilość roztworu wzorcowego (3.10.3). Ilość dodanego lasalocidu-soli sodowej powinna być zbliżona do ilości lasalocidu-soli sodowej znajdującej się w ekstrakcie próbki. Jedynie wysokość piku lasalocidu-soli sodowej powinna być wzmocniona do rozmiaru opartego na dodanej ilości lasalocidu-soli sodowej i rozpuszczeniu ekstraktu. Szerokość piku, w połowie wysokości, musi się mieścić między ± 10% pierwotnej szerokości piku niewzmocnionego ekstraktu próbki.

7.2. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać:

- 15% względem większej zawartości lasalocidu-soli sodowej, od 30 mg/kg do 100 mg/kg;

- 15 mg/kg względem zawartości lasalocidu-soli sodowej, od 100 mg/kg do 200 mg/kg;

- 7,5% względem większej zawartości lasalocidu-soli sodowej, powyżej 200 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku próbki wzmocnonej (ślepej) odzysk powinien wynosić co najmniej 80%. W przypadku próbki wzmocnionej premiksu (ślepej), odzysk powinien wynosić co najmniej 90%.

8. Wyniki badań zbiorowych

Zorganizowano badanie zbiorowe, w ramach którego we współpracy z dwunastoma innymi laboratoriami(⁴), przeprowadzono analizę 2 premiksów (próbki 1 i 2) oraz 5 pasz (próbki 3-7). Przeprowadzono analizę każdej próbki dwukrotnie. Wyniki są zamieszczone w poniższej tabeli:

	Próbka 1 Premiks dla kurcza-ków	Próbka 2 Premiks dla indyków	Próbka 3 Granulki dla indyków	Próbka 4 Okruchy dla kurcza-ków	Próbka 5 Pasza dla indyków	Próbka 6 Pasza dla drobiu A	Próbka 7 Pasza dla drobiu B
L	12	12	12	12	12	12	12
N	23	23	23	23	23	23	23
Średnio (mg/kg)	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
Sr (mg/mg)	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
Cvr (%)	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
SR (mg/kg)	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR (%)	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Zawartość nominalna (mg/kg)	5 000*	16 000*	80*	105*	120*	50+	35+
L = liczba laboratoriów N = liczba poszczególnych wyników Sr = standardowe odchylenie powtarzalności SR = standardowe odchylenie odtwarzalności wyników CVr = odchylenie standardowe zmienne powtarzalności, % CVR = odchylenie standardowe zmienne odtwarzalności, % * zawartość zadeklarowana przez producenta + pasza przygotowana w laboratorium