Akt prawny
obowiązujący
Wersja aktualna
Wersja aktualna
obowiązujący
Alerty
JEDENASTA DYREKTYWA KOMISJI 93/70/EWG
z dnia 28 lipca 1993 r.
ustanawiająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz
KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,
uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,
uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz(1), ostatnio zmieniona rozporządzeniem (EWG) nr 3768/85(2), w szczególności jej art. 2,
a także mając na uwadze, co następuje:
dyrektywa 70/373/EWG wymaga, aby urzędowe kontrole pasz były przeprowadzane przy użyciu wspólnotowych metody pobierania próbek i analizy w celu sprawdzenia zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych lub administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;
należy ustalić wspólnotową metodę analizy dotyczącą dodatku halofuginonu w celu jej wykorzystywania przy sprawdzaniu zgodności z warunkami jego stosowania w żywieniu zwierząt;
środki przyjęte w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,
PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:
Artykuł 1
Państwa Członkowskie wymagają, aby do analizy zawartości halofuginonu, do celów urzędowej kontroli pasz, stosowana była metoda opisana w Załączniku do niniejszej dyrektywy.
Artykuł 2
Państwa Członkowskie wprowadzą w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 30 czerwca 1994 r. i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.
Przepisy przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Metody dokonywania takiego odniesienia określane są przez Państwa Członkowskie.
Artykuł 3
Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.
Sporządzono w Brukseli, dnia 28 lipca 1993 r.
| W imieniu Komisji | |
| René STEICHEN | |
| Członek Komisji |
(1) Dz.U. nr L 170 z 3.8.1970, str. 2.
(2) Dz.U. nr L 362 z 31.12.1985, str. 8.
ZAŁĄCZNIK
OZNACZANIE HALOFUGINONU
DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-3-hydroksy-2-piperydyl)acetonyl] -chinazolina-4-(3H)-jednohydrobromian.
1. Cel i zakres
Metoda ta służy oznaczaniu zawartości halofuginonu w paszach. Dolną granica oznaczenia wynosi 1 mg/kg.
2. Zasada
Poddany działaniu gorącej wody halofuginon jest ekstrahowany jako wolna zasada w octanie etylowym, a następnie rozdzielona jako związek chlorowodorowy w wodnym roztworze kwasu. Ekstrakt jest oczyszczany metodą chromatografii jonowymiennej. Zawartość halofuginonu jest oznaczana za pomocą chromatografii cieczowej wysokiej wydajności z odwróconymi fazami (HPLC) z wykorzystaniem detektora UV.
3. Odczynniki
3.1. Acetonitryl, klasa HPLC
3.2. Żywica amberlitowa XAD-2
3.3. Octan amonowy
3.4. Octan etylowy
3.5. Lodowy kwas octowy
3.6. Wzorcowy halofuginon (DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-3-hydroksy-2-piperydyl)acetonyl] -chinazolina-4-(3H)-jednohydrobromian, E 764)
3.6.1. Wzorcowy roztwór halofuginonu o stężeniu 100 µg/ml
Odważyć 50 mg halofuginonu (ppkt 3.6) z dokładnością do 0,1 mg w kolbie z podziałką o pojemności 500 ml, rozpuścić w buforowym roztworze octanu amonowego (ppkt 3.18), uzupełnić do oznaczenia roztworem buforowym i zamieszać. Roztwór ten przechowywany bez dopływu światła zachowuje stabilność przez trzy tygodnie w temperaturze 5 °C.
3.6.2. Roztwory wzorcowe.
Do kilku kolb z podziałką o pojemności 100 ml przenieść 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 6,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (ppkt 3.6.1). Uzupełnić do oznaczenia fazą ruchomą (ppkt 3.21) i wymieszać. Roztwory te mają odpowiednio stężenia 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 6,0 µg/ml halofuginonu Roztwory te należy przygotowywać tuż przed użyciem.
3.7. Kwas chlorowodorowy (ρ20 około 1,16 g/ml).
3.8. Metanol
3.9. Azotan srebra
3.10. Askorbinian sodu
3.11. Węglan sodu
3.12. Chlorek sodu
3.13. EDTA (kwas etylenodwuaminoczterooctowy, sól disodowa)
3.14. Woda, klasa HPLC
3.15. Roztwór węglanu sodowego, β = 10 g/100 ml
3.16. Roztwór węglanu sodowego nasycony chlorkiem sodowym, β = 5 g/100 ml
Rozpuścić 50 g węglanu sodowego (ppkt 3.11) w wodzie, rozcieńczyć w stosunku 1:1 i dodawać chlorek sodu (ppkt 3.12) aż do nasycenia roztworu.
3.17. Kwas chlorowodorowy o stężeniu 0,1 mol/l
Sporządzić roztwór 10 ml HCl (ppkt 3.7) w wodzie w stosunku 1: 1.
3.18. Roztwór buforowy octanu amonowego, w przybliżeniu 0,25.
Rozpuścić 19,3 g octanu amonowego (ppkt 3.3) i 30 ml kwasu octowego (ppkt 3.5) w wodzie (ppkt 3.14) i rozcieńczyć w stosunku 1:1.
3.19. Przygotowanie żywicy amberlitowej XAD-2
Płukać odpowiednią ilość amberlitu (ppkt 3.2) w wodzie dopóki nie zostaną usunięte wszystkie jony chlorkowe, zgodnie ze wskazaniami badania azotanem srebra (ppkt 3.20) przeprowadzanego na odrzuconej fazie ciekłej. Następnie wypłukać żywicę w 50 ml metanolu (ppkt 3.8), wylać metanol i przechowywać żywicę w świeżym metanolu.
3.20. Roztwór azotanu srebra o stężeniu około 1 mol/l
Rozpuścić 0,17 g azotanu srebra (ppkt 3.9) w 10 ml wody.
3.21. Faza ruchoma chromatografii cieczowej HPLC
Wymieszać 500 ml acetonitrylu (ppkt 3.1) z 300 ml buforowego roztworu octanu amonowego (ppkt 3.18) i 1 200 ml wody (ppkt 3.14). Skorygować pH do poziomu 4,3 stosując w tym celu kwas octowy (ppkt 3.5). Przefiltrować przez filtr 0,22 µm (ppkt 4.8) i odgazować roztwór (np. stosując ultradźwięki przez 10 min.). Roztwór ten przechowywany bez dopływu światła w zamkniętym naczyniu zachowuje stabilność przez jeden miesiąc.
4. Aparatura
4.1. Łaźnia ultradźwiękowa
4.2. Obrotowy aparat wyparny
4.3. Wirówka
4.4. Sprzęt do chromatografii cieczowej HPLC z detektorem promieniowania UV o różnych długościach fal lub detektor z zespołem diod.
4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 300 mm × 4 mm, C 18, napełnienie 10 mm lub inna równoważna kolumna
4.5. Szklana kolumna (300 mm × 10 mm) wyposażona w filtr ze szkła matowego i zawór.
4.6. Filtry z włókien szklanych, średnica 150 mm
4.7. Filtry membranowe, 0,45 µm
4.8. Filtry membranowe, 0,22 µm
5. Procedura
Uwaga: Halofuginon w postaci wolnej zasady jest niestabilny w roztworach zasadowym i octanu etylowego. Nie powinien on pozostawać w octanie etylowym dłużej niż przez 30 min.
5.1. Przepisy ogólne
5.1.1. Należy przeprowadzić analizę metodą ślepej próby w celu sprawdzenia obecności halofuginonu lub substancji zakłócających.
5.1.2. Test odzysku powinien być przeprowadzony poprzez analizę metodą ślepej próby, która została wzmocniona przez dodanie pewnej ilości halofuginonu, podobnego do występującego w próbce. W celu zwiększenia stężenia do poziomu 3 mg/kg dodać 300 ml wzorcowego roztworu podstawowego (ppkt 3.6.1) do 10 g ślepej próby, wymieszać i odczekać przez 10 min przed rozpoczęciem etapu ekstrakcji (ppkt 5.2).
Uwaga: do celów niniejszej metody ślepa próba powinna być podobna pod względem rodzaju do tej z badanej próbki i w czasie analizy nie powinno dojść do wykrycia halofuginonu.
5.2. Ekstrakcja
Odważyć 10 g przygotowanej próbki z dokładnością do 0,1 g do probówki wirówki o pojemności 200 ml, dodać 0,5 g askorbinianu sodu (ppkt 3.10), 0,5 g EDTA (ppkt 3.13) i 20 ml wody, a następnie wymieszać. Umieścić probówkę na 5 min. w łaźni wodnej (80 °C). Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 20 ml roztworu węglanu sodowego (ppkt 3.15) i wymieszać. Natychmiast dodać 100 ml octany etylowego (ppkt 3.4) i mocno wstrząsać w ręku przez 15 sekund. Następnie umieścić probówkę na trzy minuty w łaźni ultradźwiękowej (ppkt 4.1) i poluzować korek. Odwirowywać przez dwie minuty i zdekantować fazę octanu etylowego przez filtr z włókna szklanego (ppkt 4.6) do lejka rozdzielczego o pojemności 500 ml. Powtórzyć proces ekstrakcji próbki z drugą porcją 100 ml octanu etylowego. Płukać połączone ekstrakty przez jedną minutę używając 50 ml roztworu węglanu sodowego nasyconego chlorkiem sodowym (ppkt 3.16) i odrzucić warstwę wody.
Ekstrahować warstwę organiczną przez 1 min. za pomocą 50 ml kwasu chlorowodorowego (ppkt 3.17). Odprowadzić dolną warstwę kwasu do lejka rozdzielczego o pojemności 250 ml. Ponownie ekstrahować warstwę organiczną przez 1,5 min następną porcją 50 ml kwasu chlorowodorowego i połączyć z pierwszym ekstraktem. Wypłukać połączone ekstrakty kwasowe mieszając przez około 10 sekund z 10 ml octanu etylowego (ppkt 3.4).
Przenieść ilościowo warstwę wody do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml i odrzucić fazę organiczną. Odparować cały pozostały octan etylowy z roztworu kwasu za pomocą obrotowego aparatu wyparnego (ppkt 2.4). Temperatura łaźni wodnej nie powinna przekraczać 40 °C. W warunkach podciśnienia wynoszącego około 25 mbara i w temperaturze 38 °C cała pozostałą cześć octanu etylowego zostanie usunięta w ciągu 5 min.
5.3. Czyszczenie
5.3.1. Przygotowanie kolumny amberlitowej
Kolumna XAD-2 jest przygotowywana do ekstrakcji każdej próbki. Przenieść 10 g przygotowanego amberlitu (ppkt 3.19) do szklanej kolumny (ppkt 4.5) z metanolem (ppkt 3.8). Wprowadzić mały korek z wełny szklanej w górną część złoża żywicy. Usunąć metanol z kolumny i przepłukać żywicę za pomocą 100 ml wody zatrzymując odpływ z chwilą, gdy ciecz znajdzie się ma poziomie górnej części złoża żywicy. Przed użyciem pozostawić kolumnę na 10 min w celu ustabilizowania. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia kolumny.
5.3.2. Czyszczenie próbki.
Przenieść ekstrakt (ppkt 5.2) ilościowo do górnej części przygotowanej kolumny amberlitowej (ppkt 5.3.1) i poddać elucji odrzucając eluat. Prędkość elucji nie powinna przekraczać 20 ml/min. Wypłukać kolbę okrągłodenną za pomocą 20 ml kwasu chlorowodorowego (ppkt 3.17) i wykorzystać go do przepłukania kolumny. Usunąć wszystkie pozostałości roztworu kwasu za pomocą strumienia powietrza. Zlać popłuczyny. Dodać 100 ml metanolu (ppkt 3.8) do kolumny i umożliwić elucję 5-10 ml zbierając eluat do kolby z okrągłodennej o pojemności 250 ml. Pozostawić resztę metanolu na 10 minut, aby uzyskać równowagę między nim i żywicą i kontynuować elucję z prędkością nie przekraczającą 20 ml/min zbierając eluat do tej samej kolby z okrągłodennej. Odparować metanol w obrotowym aparacie wyparnym (ppkt 4.2), przy czym temperatura łaźni wodnej nie powinna przekraczać 40 °C. Przenieść pozostałość ilościowo do kolby kalibracyjnej o pojemności 10 ml używając fazy ruchomej (ppkt 3.21). Uzupełnić do oznaczenia fazą ruchomą i wymieszać. Podwielokrotność jest filtrowana przez filtr membranowy (ppkt 4.7). Zachować ten roztwór do oznaczenia HPLC (ppkt 5.4).
5.4. Oznaczanie za pomocą HPLC
5.4.1. Parametry
W celach orientacyjnych proponuje się zachowanie następujących warunków; można też stosować inne warunki, o ile pozwalają one uzyskać równoważne wyniki.
Kolumna do chromatografii cieczowej (ppkt 4.4.1)
Faza ruchoma do HCLP (ppkt 3.21)
Szybkość przepływu: 1,5-2 ml/min.
Długość fali wykrywania: 243 nm
Objętość iniekcji: 40-100 µl.
Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego wtryskując kilkakrotnie roztwór wzorcowy (ppkt 3.6.2) zawierający 3,0 µg/l, dopóki nie uzyska się stałych wartości szczytowych (lub obszarów) i długości czasu retencji.
5.4.2. Krzywa wzorcowa
Każdy roztwór wzorcowy wstrzyknąć kilkakrotnie (ppkt 3.6.2) i dokonać pomiarów wartości szczytowych (obszarów) dla każdego stężenia. Sporządzić wzorcowy wykres stosując średnie wartości szczytowe lub obszary roztworów wzorcowych jako rzędne oraz odpowiadające im stężenia w µg/ml jako wartości osi odciętych.
5.4.3. Roztwór próbki
Ekstrakt próbki wstrzyknąć kilkakrotnie (ppkt 5.3.2) używając takiej samej objętości jak w przypadku roztworów wzorcowych i ustalić średnią wartość szczytową (obszar) halofuginonu.
6. Obliczanie wyników
Ustalić stężenie roztworu próbki w µg/ml na podstawie średniej wartości szczytowej (obszaru) halofuginonu w roztworze próbnym przez porównanie z wykresem wzorcowym (ppkt 5.4.2).
Zawartość halofuginonu w (mg/kg) próbki oblicza się według następującego wzoru:
gdzie:
— c: stężenie halofuginonu w roztworze próbnym w µg/l,
— m: masa badanej porcji w gramach.
7. Ocena poprawności wyników
7.1. Identyczność
Identyczność analitu może być potwierdzona za pomocą chromatografii równoległej lub zastosowanie detektora z układem diod, za pomocą, którego porównywane są zakresy ekstraktu próbki i roztworu wzorcowego (ppkt 3.6.2) zawierającej 6,0 µg/ml.
7.1.1. Chromatografia równoległa
Próbny ekstrakt jest wzmacniany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu wzorcowego (ppkt 3.6.2). Ilość dodanego halofuginonu powinna być podobna do ilości szacunkowej halofuginonu odkrytej się w próbnym ekstrakcie.
Tylko wysokość szczytowej wartości halofuginonu powinna zostać podwyższona po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości jak i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość wartości szczytowej, przy połowie maksymalnej wysokości, musi mieścić się w około 10% szerokości pierwotnej.
7.1.2. Wykrywanie diodowe
Wyniki są oceniane w oparciu o następujące kryteria:
a) długość fali maksymalnej absorpcji próbki i widm wzorcowych, odnotowana dla szczytowego punktu chromatogramu musi być taka sama w ramach marginesu ustalonego poprzez zdolność rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej wynosi ona na ogół ± 2 nm;
b) między 225 a 300 nm, próbka i wzorcowe widma odnotowane dla szczytowego wierzchołka chromatogramu nie mogą różnić się dla tych części widma w zakresie 10-100% lub względnej absorbancji. To kryterium zostaje spełnione, gdy występują te same wartości maksymalne i w żadnym badanym punkcie odchylenia między dwoma widmami nie przekracza 15% absorbancji wzorcowego analitu;
c) między 225 a 300 nm, widma wartości rosnących, szczytowych i malejących ekstraktu próbki nie mogą różnić się od siebie dla tych części widma w zakresie 10-100% względnej absorbancji. Kryterium to zostaje spełnione, gdy występują takie same wartości maksymalne i we wszystkich badanych punktach odchyłka między dwoma widmami nie przekracza 15% absorbancji widma wartości szczytowej;
Jeżeli jedno z tych kryteriów nie zostanie spełnione obecność analizowanej substancji nie została potwierdzona.
7.2 Powtarzalność
Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbki nie może przekroczyć 0,5 mg/kg przy zawartości halofuginonu powyżej 3 mg/kg.
7.3 Odzysk
W przypadku wzmocnionej ślepej próbki odzysk powinien wynosić co najmniej 80%.
8. Wyniki badań porównawczych
Zorganizowano badania porównawcze(1), podczas których przeanalizowano trzy próbki w ośmiu laboratoriach.
Wyniki
| Próbka A (Ślepa) przy odbiorze | Próbka B (Mączka) | Próbka C (Granulki) | |||
| przy odbiorze | po dwóch miesiącach | przy odbiorze | po dwóch miesiącach | ||
| Średnia1 | n.d. | 2,80 | 2,42 | 2,89 | 2,45 |
| SR | — | 0,45 | 0,43 | 0,40 | 0,42 |
| CVR | — | 16 | 18 | 14 | 17 |
| rec. | 86 | 74 | 88 | 75 | |
| 1: jednostki w mg/kg. n.d.: nie wykryto. SR: odchylenie standardowe powtarzalności. CVR: współczynnik zmienności (%). rec.: odzysk (%). | |||||
(1) The Analyst 108 z 1983 r., str. 1252-1256.
