ZAŁĄCZNIK

OZNACZANIE SPIRAMYCYNY POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. Cel i zakres

Metoda służy oznaczaniu spiramycyny w paszach i premiksach. Dolna granica oznaczenia to 1 mg/kg (1 ppm)(¹³).

2. Zasada

Próbka jest ługowana przy pomocy mieszaniny metanolu / roztworu buforowego będącego wodorowęglanem fosforanowym, o współczynniku pH 8. Ekstrakt jest dekantowany bądź odwirowywany i rozcieńczany. Jego aktywność antybiotykowa jest oznaczana poprzez pomiar dyfuzji spiramycyny w podłożu agaru posianym Micrococcus luteus. Dyfuzję objawia się tworzeniem stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyków w zakresie zastosowanych stężeń antybiotyków.

3. Drobnoustroje: Microcossus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Microcossus luteus na pożywce umieszczonej w probówkach (ppkt 4.1) i inkubować drobnoustroje przez 24 godziny w temperaturze 30 ºC. Przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C. Dokonywać posiewu co dwa tygodnie.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej (a)

Zebrać przyrost ze świeżo przygotowanej powierzchni agaru (ppkt 3.1) przy pomocy
2-3 ml roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3). Użyć niniejszą zawiesinę do posiania 250 ml pożywki (ppkt 4.1), zawartej w kolbie Rouxa i inkubować 18-20 godzin w temperaturze 30 ºC. Zebrać przyrost w 25 ml roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3) i wymieszać. Rozcieńczyć roztwór dziesięciokrotnie przy pomocy roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3). Transmisja światła zawiesiny powinno przechodzić przez zawiesinę, zmierzona przy 650 nm, w naczynku 1cm w stosunku do roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3), powinna wynosić około 75%. Zawiesina ta może być przechowywana przez tydzień w temperaturze około 4 °C.

4. Pożywki i odczynniki

4.1. Pożywka (b)

4.2. Odczynnik do oznaczenia (b)

4.3. 0,8% (stężenie wagowe) roztwór chlorku sodowego

Rozpuścić 8 g chlorku sodowego w wodzie i rozcieńczyć do 1 000 ml; poddać sterylizacji.

4.4. Buforowy roztwór wodorowęglanu fosforanu, pH 8,0

4.5. Mieszanina roztworu buforowego wodorowęglanu fosforanu (ppkt 4.4)

50/50 (objętościowo / objętościowo).

4.6. Substancja wzorcowa

Spiramycyna o znanej aktywności (w jednostkach międzynarodowych).

5. Roztwory wzorcowe

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji wzorcowej (ppkt 4.6) w mieszaninie (ppkt 4.5) i rozcieńczyć tą samą mieszaniną, aby uzyskać roztwór podstawowy zawierający 1 000 jednostek międzynarodowych spiramycyny na mililitr. Roztwór ten przechowywany w zakorkowanej kolbie w temperaturze 4 °C jest stabilny przez pięć dni.

Na bazie tego roztworu, rozcieńczając go stopniowo przy pomocy mieszaniny (ppkt 4.5) należy przygotować następujące roztwory:

S₈ 1 j.m./ml

S₄ 0,5 j.m./ml

S₂ 0,25 j.m./ml

S₁ 0,125 j.m./ml

6. Przygotowanie ekstraktu i roztworów do oznaczania

6.1. Ekstrakcja

Odważyć próbkę 20,0 g w przypadku pasz, oraz 1,0-20,0 g w przypadku premiksów. Dodać 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i potrząsać przez 30 minut. Odwirować lub dekantować, a ciecz zlaną znad osadu rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), aby uzyskać oczekiwaną zawartość spiramycyny wynoszącą 1 j.m./ml (= U₈).

W przypadku oczekiwanych zawartości spiramycyny poniżej 2.5 mg/kg paszy proces ekstrakcji musi być przeprowadzony w następujący sposób. Należy odważyć próbkę 20,0 g. Dodać 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i potrząsać przez 30 minut. Odwirować przez kilka minut, wziąć 50 ml cieczy zlanej znad osadu i odparować do objętości około 4 ml w warunkach zmniejszonego ciśnienia w obrotowej wyparce w temperaturze 40 ºC. Pozostałości należy rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), aby uzyskać oczekiwaną zawartość spiramycyny wynoszącą 1 j.m./ml (= U₈).

6.2. Roztwory do oznaczania

Z roztworu U₈ przygotować roztwory U₄ (zakładana zawartość: 0,5 j.m./ml), U₂ (zakładana zawartość: 0,25 j.m./ml) oraz U₁ (zakładana zawartość: 0,125 j.m./ml) w drodze kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy pomocy mieszaniny (ppkt 4.5).

7. Procedura oznaczania

7.1. Posiew odczynnika do oznaczania

Dokonać posiewu odczynnika do oznaczania (ppkt 4.2) przy pomocy zawiesiny bakteryjnej (ppkt 3.2) w temperaturze około 50 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (ppkt 4.2) ustalić ilość zawiesiny bakteryjnej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych wielkościach stężenia spiramycyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U₈, U₄, U₂, U₁). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. W tym celu, wybrać odpowiednio duże płytki dla umożliwienia wykonania co najmniej ośmiu otworów o średnicy 10-13 mm i nie mniej niż 30 mm między środkami, w podłożu agarowym. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm wysokości.

Do płytek wlać odpowiednią ilość odczynnika (ppkt 4.2), posianego zgodnie z opisem w ppkt. 7.1, aby uzyskać 2 mm warstewkę (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić przez chwilę do ustalenia poziomu powierzchni, następnie naciąć otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone ilości roztworów do oznaczania i wzorcowych (0,10-0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą). Zastosować każde stężenie co najmniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki 16-18 godzin w temperaturze 30 °C ± 2 °C.

8. Ocena

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności do średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL) stosując następujący wzór:

a)

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując następujący wzór:

b)

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH) wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości s₁, s₄ i s₈ wartości u₁, u₂ i u₄(¹⁴).

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10% od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo u₁ i s₁ lub u₈ i s₈ mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie, łączące punkty o najlepszej zgodności:

a’)

b’)

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności, powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. Fakt, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log. A) stosując wzór podany poniżej, w zależności od tego czy do oceny równoległości zastosowano trzy lub też cztery poziomy.

Dla czterech poziomów

c)

Dla trzech poziomów

d)

lub

d’)

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana x aktywność względna A

(U₈ = S₈ x A)

Jeśli okaże się, że względna aktywność nie mieści się w przedziale 0,5-2,0, powtórzyć procedurę oznaczenia po odpowiednim skorygowaniu stężeń ekstraktu lub, jeżeli nie jest to możliwe, to roztworów wzorcowych. Gdy nie można osiągnąć wartości względnej aktywności w wymaganych zakresie, to dowolny uzyskany wynik powinien być wzięty pod uwagę jako wynik przybliżony, co należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

W przypadku, gdy linie nie są równoległe, powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe oznaczenie uznaje się za niezadowalające.

Wynik podaje się w miligramach bazowej spiramycyny na kilogram paszy.

9. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbie, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

- 2 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości roztworu bazowego spiramycyny do 10 mg/kg,

- 20% w przypadku najwyższej zawartości spiramycyny w przedziale 10-25 mg/kg,

- 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości spiramycyny w przedziale 25-50 mg/kg,

- 10% w przypadku najwyższej zawartości powyżej 50 mg/kg.