Akt prawny
obowiązujący
Wersja aktualna
Wersja aktualna
obowiązujący
Alerty
DZIESIĄTA DYREKTYWA KOMISJI
z dnia 25 lipca 1984 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (84/425/EWG)
Dziennik Urzędowy nr L 238 06/09/1984 s.34
KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,
uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,
uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz(1), ostatnio zmienioną Aktem Przystąpienia Grecji, w szczególności jej art. 2,
a także mając na uwadze, co następuje:
dyrektywa stawia wymóg, aby urzędowa kontrola pasz była przeprowadzana przy użyciu wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów sprawdzania zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych lub administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;
w dyrektywach Komisji 71/250/EWG(2), 73/46/EWG(3), 74/203/EWG(4), 75/84/EWG(5), 76/372/EWG(6), ostatnio zmienionych dyrektywą 81/680/EWG(7), dyrektywach 71/393/EWG(8), 72/199/EWG(9), 78/633/EWG(10), ostatnio zmienionych dyrektywą 84/4/EWG(11) oraz w dyrektywie 81/715/EWG(12) ustanowiono już szereg metod analizy; ze względu na dokonane od tamtej pory postępy prac zalecane byłoby przyjęcie nowych metod;
środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,
PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:
Artykuł 1
Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy do celów urzędowej kontroli pasz w odniesieniu do zawartości spiramycyny były przeprowadzane zgodnie z metodą opisaną w Załączniku.
Artykuł 2
Państwa Członkowskie wprowadzą w życie, najpóźniej do dnia 30 czerwca 1985 r. przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.
Artykuł 3
Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.
Sporządzono w Brukseli, dnia 25 lipca 1984 r.
W imieniu Komisji
Poul DALSAGER
Członek Komisji
ZAŁĄCZNIK
OZNACZANIE SPIRAMYCYNY POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM
1. Cel i zakres
Metoda służy oznaczaniu spiramycyny w paszach i premiksach. Dolna granica oznaczenia to 1 mg/kg (1 ppm)(13).
2. Zasada
Próbka jest ługowana przy pomocy mieszaniny metanolu / roztworu buforowego będącego wodorowęglanem fosforanowym, o współczynniku pH 8. Ekstrakt jest dekantowany bądź odwirowywany i rozcieńczany. Jego aktywność antybiotykowa jest oznaczana poprzez pomiar dyfuzji spiramycyny w podłożu agaru posianym Micrococcus luteus. Dyfuzję objawia się tworzeniem stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyków w zakresie zastosowanych stężeń antybiotyków.
3. Drobnoustroje: Microcossus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)
3.1. Utrzymanie kultury macierzystej
Dokonać posiewu Microcossus luteus na pożywce umieszczonej w probówkach (ppkt 4.1) i inkubować drobnoustroje przez 24 godziny w temperaturze 30 ºC. Przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C. Dokonywać posiewu co dwa tygodnie.
3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej (a)
Zebrać przyrost ze świeżo przygotowanej powierzchni agaru (ppkt 3.1) przy pomocy
2-3 ml roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3). Użyć niniejszą zawiesinę do posiania 250 ml pożywki (ppkt 4.1), zawartej w kolbie Rouxa i inkubować 18-20 godzin w temperaturze 30 ºC. Zebrać przyrost w 25 ml roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3) i wymieszać. Rozcieńczyć roztwór dziesięciokrotnie przy pomocy roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3). Transmisja światła zawiesiny powinno przechodzić przez zawiesinę, zmierzona przy 650 nm, w naczynku 1cm w stosunku do roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3), powinna wynosić około 75%. Zawiesina ta może być przechowywana przez tydzień w temperaturze około 4 °C.
4. Pożywki i odczynniki
4.1. Pożywka (b)
Pepton mięsa
Trypton
Ekstrakt z drożdży
Ekstrakt z mięsa
Glukoza
Agar
Woda
pH 6,5-6,6 (po sterylizacji). | 6,0 g
4,0 g
3,0 g
1,5 g
1,0 g
10,0-20,0 g
1 000 ml |
4.2. Odczynnik do oznaczenia (b)
Trypton
Ekstrakt drożdży
Ekstrakt z mięsa
Agar
Woda
pH 8.0 (po sterylizacji). | 5,0 g
4,0 g
3,0 g
10,0-20,0 g
1 000 ml |
4.3. 0,8% (stężenie wagowe) roztwór chlorku sodowego
Rozpuścić 8 g chlorku sodowego w wodzie i rozcieńczyć do 1 000 ml; poddać sterylizacji.
4.4. Buforowy roztwór wodorowęglanu fosforanu, pH 8,0
Wodorofosforan dwupotasowy K2HPO4
Dwuwodorofosforan potasu KH2PO4
Wodorowęglan sodu NaHCO3
Woda do | 16,7 g
0,5 g
20,0 g
1 000 ml |
4.5. Mieszanina roztworu buforowego wodorowęglanu fosforanu (ppkt 4.4)
50/50 (objętościowo / objętościowo).
4.6. Substancja wzorcowa
Spiramycyna o znanej aktywności (w jednostkach międzynarodowych).
5. Roztwory wzorcowe
Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji wzorcowej (ppkt 4.6) w mieszaninie (ppkt 4.5) i rozcieńczyć tą samą mieszaniną, aby uzyskać roztwór podstawowy zawierający 1 000 jednostek międzynarodowych spiramycyny na mililitr. Roztwór ten przechowywany w zakorkowanej kolbie w temperaturze 4 °C jest stabilny przez pięć dni.
Na bazie tego roztworu, rozcieńczając go stopniowo przy pomocy mieszaniny (ppkt 4.5) należy przygotować następujące roztwory:
S8 1 j.m./ml
S4 0,5 j.m./ml
S2 0,25 j.m./ml
S1 0,125 j.m./ml
6. Przygotowanie ekstraktu i roztworów do oznaczania
6.1. Ekstrakcja
Odważyć próbkę 20,0 g w przypadku pasz, oraz 1,0-20,0 g w przypadku premiksów. Dodać 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i potrząsać przez 30 minut. Odwirować lub dekantować, a ciecz zlaną znad osadu rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), aby uzyskać oczekiwaną zawartość spiramycyny wynoszącą 1 j.m./ml (= U8).
W przypadku oczekiwanych zawartości spiramycyny poniżej 2.5 mg/kg paszy proces ekstrakcji musi być przeprowadzony w następujący sposób. Należy odważyć próbkę 20,0 g. Dodać 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i potrząsać przez 30 minut. Odwirować przez kilka minut, wziąć 50 ml cieczy zlanej znad osadu i odparować do objętości około 4 ml w warunkach zmniejszonego ciśnienia w obrotowej wyparce w temperaturze 40 ºC. Pozostałości należy rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), aby uzyskać oczekiwaną zawartość spiramycyny wynoszącą 1 j.m./ml (= U8).
6.2. Roztwory do oznaczania
Z roztworu U8 przygotować roztwory U4 (zakładana zawartość: 0,5 j.m./ml), U2 (zakładana zawartość: 0,25 j.m./ml) oraz U1 (zakładana zawartość: 0,125 j.m./ml) w drodze kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy pomocy mieszaniny (ppkt 4.5).
7. Procedura oznaczania
7.1. Posiew odczynnika do oznaczania
Dokonać posiewu odczynnika do oznaczania (ppkt 4.2) przy pomocy zawiesiny bakteryjnej (ppkt 3.2) w temperaturze około 50 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (ppkt 4.2) ustalić ilość zawiesiny bakteryjnej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych wielkościach stężenia spiramycyny.
7.2. Przygotowanie płytek
Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S8, S4, S2, S1) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U8, U4, U2, U1). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. W tym celu, wybrać odpowiednio duże płytki dla umożliwienia wykonania co najmniej ośmiu otworów o średnicy 10-13 mm i nie mniej niż 30 mm między środkami, w podłożu agarowym. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm wysokości.
Do płytek wlać odpowiednią ilość odczynnika (ppkt 4.2), posianego zgodnie z opisem w ppkt. 7.1, aby uzyskać 2 mm warstewkę (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić przez chwilę do ustalenia poziomu powierzchni, następnie naciąć otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone ilości roztworów do oznaczania i wzorcowych (0,10-0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą). Zastosować każde stężenie co najmniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.
7.3. Inkubacja
Inkubować płytki 16-18 godzin w temperaturze 30 °C ± 2 °C.
8. Ocena
Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności do średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.
Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL) stosując następujący wzór:
a)
Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując następujący wzór:
b)
W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH) wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości s1, s4 i s8 wartości u1, u2 i u4(14).
Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej dla ekstraktu.
W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10% od ich wartości średniej.
Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo u1 i s1 lub u8 i s8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie, łączące punkty o najlepszej zgodności:
a’)
b’)
i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności, powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. Fakt, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.
Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log. A) stosując wzór podany poniżej, w zależności od tego czy do oceny równoległości zastosowano trzy lub też cztery poziomy.
Dla czterech poziomów
c)
Dla trzech poziomów
d)
lub
d’)
Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana x aktywność względna A
(U8 = S8 x A)
Jeśli okaże się, że względna aktywność nie mieści się w przedziale 0,5-2,0, powtórzyć procedurę oznaczenia po odpowiednim skorygowaniu stężeń ekstraktu lub, jeżeli nie jest to możliwe, to roztworów wzorcowych. Gdy nie można osiągnąć wartości względnej aktywności w wymaganych zakresie, to dowolny uzyskany wynik powinien być wzięty pod uwagę jako wynik przybliżony, co należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.
W przypadku, gdy linie nie są równoległe, powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe oznaczenie uznaje się za niezadowalające.
Wynik podaje się w miligramach bazowej spiramycyny na kilogram paszy.
9. Powtarzalność
Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbie, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:
- 2 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości roztworu bazowego spiramycyny do 10 mg/kg,
- 20% w przypadku najwyższej zawartości spiramycyny w przedziale 10-25 mg/kg,
- 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości spiramycyny w przedziale 25-50 mg/kg,
- 10% w przypadku najwyższej zawartości powyżej 50 mg/kg.
[1] Dz.U. nr L 170 z 3.8.1970, str. 2.
[2] Dz.U. nr L 155 z 12.7.1971, str. 13.
[3] Dz.U. nr L 83 z 30.3.1973, str. 21.
[4] Dz.U. nr L 108 z 22.4.1974, str. 7.
[5] Dz.U. nr L 32 z 5.2.1975, str. 26.
[6] Dz.U. nr 102 z 15.4.1976, str. 8.
[7] Dz.U. nr L 246 z 29.8.1981, str. 32.
[8] Dz.U. nr L 279 z 20.12.1971, str. 7.
[9] Dz.U. nr L 123 z 29.5.1972, str. 6.
[10] Dz.U. nr L 206 z 29.7.1978, str. 43.
[11] Dz.U. nr L 15 z 18.1.1984, str. 28.
[12] Dz.U. nr L 257 z 10.9.1981, str. 38.
[13] 1 mg roztworu bazowego spiramycyny równa się 3 200 jednostkom międzynarodowym (IU).
(a) Mogą być stosowane inne metody pod warunkiem, że ustalono, że dają one takie same zawiesiny bakteryjne.
(b) Może być użyta dowolna inna, dostępna w handlu, pożywka o podobnym składzie i dająca takie same rezultaty.
[14] Małe litery „s” i „u” odnoszą się do średnic stref hamujących.