1. CEL I ZAKRES METODY

Metoda służy oznaczaniu monensinu sodowego w paszach, koncentratach i premiksach. Dolna granica oznaczenia 10 mg/kg (10 ppm)(³).

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana przy pomocy 90% metanolu. Ekstrakt jest poddawany właściwym procedurom w zależności od zawartości monensinu sodowego w próbce. Działanie antybiotykowe jest oznaczane poprzez pomiar dyfuzji monensinu sodowego w podłożu agaru, posianym bakteriami Bacillus subtilis. Dyfuzję widać po utworzeniu się stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest bezpośrednio proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku. Czułość tego układu do oznaczania zawartości monensinu sodowego jest mniejsza w przypadku obecności jonów sodu.

3. MIKROORGANIZM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej(⁴)

Dokonać posiewu Bacillus subtilis na pożywce umieszczonej w próbówkach (4.1) i inkubować przez noc w temperaturze 30⁰C. Przechowywać w lodówce w temperaturze około 4⁰C. Ponawiać posiew co miesiąc.

3.2. Przygotowanie zawiesiny przetrwalnikowej

Zebrać przyrost z ostatnio przygotowanego wyciągu agaru (3.1) przy pomocy 2-3 ml sterylnej wody. Tak przygotowaną zawiesinę używać do posiewu 300 ml pożywki (4.1), zawartej w kolbie Rouxa i inkubować od trzech do pięciu dni w temperaturze 30 °C. Zebrać przyrost w 15 ml 20% etanolu (4.3), po uprzednim sprawdzeniu przetrwalników pod mikroskopem, i dobrym wymieszaniu. Niniejszą zawiesinę można przechowywać przynajmniej pięć miesięcy w temperaturze 4 °C.

4. POŻYWKI I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywka(⁵)

Trypton 10,0 g

Ekstrakt z drożdży 3,0 g

Ekstrakt z mięsa 1,5 g

Glukoza 1,0 g

Agar (zgodnie z jakością) 10,0 g do 20,0 g

Woda 1 000 ml

pH 6.5 (po sterylizacji)

4.2. Odczynnik do oznaczania

Glukoza 10,0 g

Ekstrakt z drożdży 2,5 g

Wodorofosforan dwupotasowy K₂HPO₄ 0,69 g

Dwuwodorofosforan potasu KH₂PO₄ 0,45 g

Agar (zgodnie z jakością) 10,0 g do 20,0 g

Woda 1 000 ml

pH 6 (po sterylizacji)

4.3. 20% etanol (objętościowo): rozpuścić 200 ml etanolu w 800 ml wody.

4.4. Metanol bezwodny.

4.5. 90% metanol (objętościowo): rozpuścić 900 ml metanolu (4.4) w 100 ml wody.

4.6. 50% metanol (objętościowo): rozpuścić 500 ml metanolu (4.4) w 500 ml wody.

4.7. Granulowany tlenek glinowy (alcoa F, wielkość oczka siatki 20,: aktywowany tlenek glinowy UGI: F. Lancaster & Co. lub równoważny).

4.8. Substancje wzorcowe: monensin sodowy o znanej aktywności (np. z Międzynarodowego Laboratorium Norm Biologicznych. Centralne Laboratorium Weterynaryjne. Weybridge, UK Surrey KT 15 3 NB).

5. APARATURA

5.1. Obrotowa wyparka próżniowa, z 250 ml kolbą o okrągłym dnie.

5.2. Szklana probówka dla chromatografii, średnica wewnętrzna: 25 mm, długość: 400 mm, przy czym otwarty koniec ma średnicę 2 mm.

5.3. Szklana probówka dla chromatografii, średnica wewnętrzna: 11 mm, długość ok. 300 mm, przy czym otwarty koniec ma średnicę 2 mm.

6. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość około 10 mg substancji podstawowej (4.8) w metanolu (4.4), a następnie rozcieńczyć, aby otrzymać roztwór podstawowy, zawierający 800 μg monensinu sodowego na mililitr. Roztwór ten przechowywany w zakorkowanej kolbie w temperaturze 4 °C jest stabilny maksymalnie przez maksymalnie dwa tygodnie.

Na bazie roztworu podstawowego rozcieńczając go stopniowo przy pomocy roztworu buforowego (4.5) należy przygotować następujące roztwory:

S₈ 8,0 μg/ml

S₄ 4,0 μg/ml

S₂ 2,0 μg/ml

S₁ 1,0 μg/ml

7. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

7.1. Ekstrakcja

7.1.1. Premiksy

Odważyć próbkę o wadze 2 mg, dodać 100 ml 90% metanolu (4.5), poddać homogenizacji i odwirowaniu przez kilka minut. Rozcieńczyć ciecz sklarowaną nad osadem przy pomocy 50% metanolu (4.6), aby uzyskać oczekiwaną zawartość monensinu sodu wynoszącą 8 μg/ml (= U₈).

7.1.2. Pasze z zawartością monensinu sodu co najmniej 50 ppm

Odważyć próbkę od 10 do 20 g, dodać 100 ml 90% metanolu (4.5), homogenizować przez 15 minut i odstawić do osadzenia się.

Do wąskiego końca probówki szklanej (5.2) włożyć zatyczkę z waty i dodać tlenku glinowego (4.7), a następnie delikatnie pobierać aż poziom w kolumnie osiągnie 75-80 mm.

Zlać ciecz znad osadu ekstraktu do kolumny z tlenkiem glinowym i zebrać filtrat. Rozcieńczyć 30 ml filtratu przy pomocy 50 ml wody. Kolejne rozcieńczenia należy wykonywać stosując 50% metanol (4.6), aby uzyskać oczekiwaną zawartość monensinu sodu w wysokości 8 μg/ml (= U₈).

7.1.3. Pasze z zawartością monensinu sodu poniżej 50 ppm (do poziomu 10 ppm)

Odważyć próbkę od 10 do 20 g, dodać 100 ml 90% metanolu (4.5), homogenizować przez 15 minut i odwirować w celu sklarowania.

Aby uzyskać próbkę zawierającą 20 ppm monensinu sodu, należy wziąć 40 ml cieczy sklarowanej nad osadem, natomiast w celu uzyskania próbki zawierającej 10 ppm, należy wziąć 80 ml i odparować do sucha w próżni na obrotowej wyparce (5.1) w maksymalnej temperaturze 40⁰C. Resztę należy rozpuścić w 10 ml 90% metanolu (4.5).

Do wąskiego końca probówki szklanej (5.2) włożyć zatyczkę z waty i dodać tlenku glinowego (4.7), a następnie delikatnie pobierać aż poziom w kolumnie osiągnie 75-80 mm.

Zlać ciecz znad osadu ekstraktu do kolumny z tlenkiem glinowym i zebrać filtrat. Przepłukać kolumnę 10 ml 90% metanolu (4.5) i wymieszać popłuczyny z filtratem.

Odparować roztwór do sucha w próżni przy użyciu wyparki obrotowej (5.1) w temperaturze poniżej 40 °C. Resztę należy rozpuścić w 10 ml bezwodnego metanolu (4.4) i uzupełnić objętość wodą do 20 ml. Odwirować roztwór z szybkością przynajmniej 4 000 obrotów na minutę przez minimum pięć minut. Do kolejnych rozcieńczeń należy używać 50% metanolu (4.6), aby uzyskać oczekiwaną zawartość monensinu sodu w wysokości 8 μg/ml (= U₈).

7.2. Roztwory do oznaczania

Na bazie roztworu U₈ należy przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość: 4 μg/ml), U₂ (oczekiwana zawartość: 2 μg/ml) i U₁ (oczekiwana zawartość: 1 μg/ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu 50% metanolu (4.6).

8. PROCEDURA OZNACZANIA

8.1. Posiew czynnika do oznaczania

Dokonać posiewu czynnika do oznaczania (4.2) przy pomocy zawiesiny przetrwalnikowej (3.2) w temperaturze od 50 °C do 60 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (4.2) należy ustalić ilość zawiesiny przetrwalnikowej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych poziomach stężenia monensinu sodu.

8.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U₈, U₄, U₂, U₁). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorzec muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. Mając to na uwadze, należy wybrać odpowiednio duże płytki, które zmieszczą przynajmniej osiem otworów o średnicy od 10 do 13 mm, przy czym odległość między środkami otworów, które mają być zrobione w podłożu agaru, nie może być mniejsza niż 30 mm. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm grubości.

Do płytek należy wlać odpowiednią ilość odczynnika (4.2), posianego zgodnie z opisem w pkt. 8.1, aby uzyskać 2 mm warstewkę (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Zostawić przez chwilę, aby powierzchnia się wyrównała, następnie nawiercić otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów do oznaczania i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą). Roztwór o każdym stężeniu należy stosować przynamniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.

8.3. Inkubacja

Inkubować płytki około 18 godzin w temperaturze od 35 do 37⁰C.

9. OCENA

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności od średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL) stosując następujący wzór:

a)

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując wzór:

b)

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH) wstawiając w powyższych wzorach wartości U₁, U₂ i U₄ w miejsce wartości S₁, S₄ i S₈.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej zgodności, dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10% od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo U1 i S1 lub U8 i S8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie, łączące punkty o najlepszej zgodności:

a’) lub

b’) lub

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności, powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. To, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log. A) za pomocą jednego z następujących wzorów.

Dla czterech poziomów:

c)

Dla trzech poziomów:

d)

lub

d’)

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana x aktywność względna

Jeśli okaże się, że względna aktywność nie mieści się w zakresie 0.5-2.0, to należy powtórzyć procedurę oznaczenia po odpowiednim skorygowaniu stężeń ekstraktu lub, jeśli to nie jest możliwe, roztworów wzorcowych. Kiedy nie można osiągnąć wartości względnej aktywności w wymaganym zakresie, to dowolny uzyskany wynik powinien być uznany za przybliżony, co powinno zostać odnotowane w sprawozdaniu końcowym..

W przypadku gdy linie nie są równoległe, należy powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe to należy oznaczenie uznać za niezadowalające.

10. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

– 20% w przypadku najwyższej zawartości monensinu sodu w przedziale od 10 do 25 mg/kg,

– 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości monensinu sodu w przedziale od 25 do 50 mg/kg,

– 10% w przypadku najwyższej zawartości powyżej 50 mg/kg.