ZAŁĄCZNIK

1. OZNACZANIE BACYTRACYNY CYNKU POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy oznaczaniu bacytracyny cynku w paszach, koncentratach i premiksach. Dolna granica oznaczenia 5 mg/kg (5 ppm)*. Metoda jest nieważna w obecności substancji zakłócających, w szczególności dużych ilości miedzi i kwasu askorbinowego.

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana przy pH 2, mieszaniną metanolu, wody i kwasu solnego. Ekstrakt jest doprowadzany do pH 6,5, zatężany (jeśli konieczne) i rozcieńczany. Jego działanie antybiotykowe jest oznaczane poprzez pomiar dyfuzji bacytracyny cynku na podłożu agarowym posianym Micrococcus luteus (Syn.M. flavus). Dyfuzja objawia się tworzeniem stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku w zakresie zastosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: MICROCOSSUS LUTEUS ATCC 10240

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Microcossus luteus na powierzchnię pożywki agarowej (4.1). Inkubować 24 godziny w temperaturze 30-37 °C, przechować w lodówce w temperaturze około 4 °C i ponownie dokonywać posiewu, co dwa tygodnie na powierzchnie agaru.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjneja)

Zebrać przyrost ze świeżo przygotowanej powierzchni agaru (3.1) przy pomocy 2-3 ml roztworu chlorku sodowego (4.3). Użyć niniejszą zawiesinę do posiania 250 ml pożywki (4.1), zawartej w kolbie Rouxa i inkubować 8-20 godzin w temperaturze 30-37 °C. Zebrać przyrost w 25 ml roztworu chlorku sodowego (4.3) i wymieszać. Rozcieńczyć roztwór dziesięciokrotnie przy pomocy roztworu chlorku sodowego(4.3). Transmisja światła zawiesiny, zmierzona przy 650 nm, w naczynku 1 cm, w stosunku do roztworu chlorku sodowego (4.3), musi wynosić około 75%.

4. POŻYWKI I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywkab)

4.2. Odczynnik do oznaczania^b)

4.3. 0,8% (stężenie wagowe) roztwór chlorku sodowego: rozpuścić 8 g chlorku sodowego czystego analitycznie w wodzie i rozcieńczyć do 1 000 ml; poddać sterylizacji.

4.4. Mieszanina czysty metanol / woda / kwas solny czystości analitycznej (gęstość 1,18-1,19): 80/17.5/2.5 (objętościowo)*.

4.5. Buforowy fosforanowy, pH 6,5

4.6. Kwas solny czystości analitycznej (gęstość: 1,18-1,19).

4.7. Kwas solny czystości analitycznej (0,1 N)

4.8. Roztwór 1 N wodorotlenku sodowego czystości analitycznej

4.9. 0,4% (wagowo) roztwór purpury bromokrezolowej: rozpuścić 0,1 g purpury bromokrezolowej w 18,5 ml roztworu 0,01 N wodorotlenku sodowego. Dopełnić do objętości 250 ml i wymieszać.

4.10. Substancja podstawowa: bacytracyna cynku o znanej aktywności (w jednostkach międzynarodowych).

5. ROZTWORY WZORCOWE

Odważyć ilość podstawowej bacytracyny cynku (4.10) odpowiadającą 1 050 jednostkom międzynarodowym (zgodnie z podaną aktywnością). Dodać 5 ml 0,1 N kwasu solnego (4.7) i odstawić na 15 minut. Dodać 30 ml wody, skorygować pH do 4,5 przy pomocy roztworu buforowego fosforanu o pH 6,5 (4.5) (około 4 ml), uzupełnić objętość do 50 ml wodą i dobrze wymieszać (1 ml = 21 jednostek międzynarodowych (j.m.)).

Z niniejszego roztworu poprzez kolejne rozcieńczanie buforem fosforanowym o pH 6,5 (4.5) przygotować następujące roztwory:

S₈ 0,42 j.m./ml

S₄ 0,21 j.m./ml

S₂ 0,105 j.m./ml

S₁ 0,0525 j.m./ml

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

6.1. Ekstrahowanie

6.1.1. Koncentraty, premiksy i pasze mineralne

Odważyć ilościowo próbkę 2,0-5,0 g, dodać 30 ml mieszaniny (4.4) i wstrząsnąć. Sprawdzić czy współczynnik pH wynosi około 2. Wstrząsać przez 10 minut, dodać 30 ml roztworu buforu fosforanowego o pH 6,5 (4.5) i wstrząsać przez 15 minut. Rozcieńczyć przy pomocy roztworu buforowego fosforanu o pH 4,5, aby uzyskać zakładaną zawartość bacytracyny cynku wynoszącą 0,42 j.m./ml) (= U₈).

6.1.2. Koncentraty białkowe

Odważyć ilościowo próbkę 10,0 g, dodać 50 ml mieszaniny (4.4) i wstrząsnąć. Sprawdzić czy pH wynosi około 2. Wstrząsać przez 10 minut, dodać 50 ml roztworu buforowego fosforanu o pH 6,5 (4,5) i wstrząsać przez 15 minut. Rozcieńczyć przy pomocy roztworu buforowego fosforanu o pH 4,5, aby uzyskać zakładaną zawartość bacytracyny cynku wynoszącą 0,42 j.m./ml) (= U₈).

6.1.3. Pozostałe pasze

Odważyć ilościowo próbkę 10,0 g (lub 20,0 g, aby otrzymać zakładaną zawartość bacytracyny cynku wynoszącą 5 mg/kg), dodać 25 ml mieszaniny (4.4) i homogenizować przez około 10 minut. Dodać 25 ml roztworu buforowego fosforanu o pH 6,5 (4.5) i wstrząsać przez 15 minut i odwirować. Wziąć 20 ml roztworu nadsączu i skorygować współczynnik pH do 6,5 przy pomocy roztworu 1 N wodorotlenku sodowego (4.8) z roztworem purpury bromokrezolowej (4.9) jako wskaźnikiem. Odparować do około 4 ml w obrotowym aparacie wyparnym w temperaturze nie przekraczającej 35 °C. Rozcieńczyć pozostałą część wodą, aby uzyskać zakładaną zawartość bacytracyny cynku wynoszącą 0,42 j.m./ml (= U₈).

6.2. Roztwory do oznaczania

Z roztworu U₈ przygotować U₄ (zakładana zawartość: 0,21 j.m./ml), U₂ (zakładana zawartość: 0,105 j.m./ml) oraz U₁ (zakładana zawartość: 0,0525 j.m./ml) na drodze kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy pomocy roztworu buforowego fosforanu (4.5).

7. PROCEDURA OZNACZANIA

7.1. Posiew odczynnika do oznaczania

Dokonać posiewu odczynnika do oznaczania (4.2) przy pomocy zawiesiny bakteryjnej (3.2) w temperaturze około 50 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (4.2) oznaczyć ilość zawiesiny bakteryjnej wymaganej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych stężeniach bacytracyny cynku.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja poprzez agar jest wykonywana na płytkach z czterema stężeniami roztworu wzorcowego (S₈, S₄, S₂, S₁) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U₈, U₄, U₂, U₁). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. W tym celu, wybrać odpowiednio duże płytki dla umożliwienia wykonania przynajmniej ośmiu otworów o średnicy 10-13 mm i nie mniej niż 30 mm między środkami, w podłożu agarowym. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na powierzchni górnej, o średnicy 200 mm i 20 mm wysokości.

Do płytek wlać odpowiednią ilość odczynnika (4.2), posianego zgodnie z opisem w pkt. 7.1, dla uzyskania 2 mm warstwy (50 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić do ustalenia poziomu powierzchni, następnie naciąć otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów do oznaczania i standardowych (0,10-0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą).

Zastosować każde stężenie przynajmniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.

7.3. Inkubacja

Płytki poddać inkubacji przez 16-18 godzin w temperaturze 28-30 °C.

8. OCENA

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności od średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL) stosując wzór:

a) SL =

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując wzór:

b) SH =

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH) wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości S1, S4 i S8 wartości U1, U2 i U4.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla roztworu wzorcowego. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10% od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo U1 i S1 lub U8 i S8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie, łączące punkty o najlepszej zgodności:

a’) SL = lub

b’) SH = lub

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności muszą być sprawdzone na równoległość jak uprzednio. Fakt, iż wynik obliczono z trzech poziomów musi być odnotowany w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log. A) za pomocą jednego z następujących wzorów.

Dla czterech poziomów:

c) log. A =

Dla trzech poziomów:

d) log. A =

lub

d’) log. A =

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana x aktywność względna

W przypadku gdy linie nie są równoległe, powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal nie uzyskuje się linii równoległych, obliczyć logarytm aktywności względnej (log. A) za pomocą wzoru c). Uzyskany wynik musi być jednak wzięty pod uwagę jako wynik przybliżony, co musi zostać odnotowane w sprawozdaniu końcowym.

9. POWTARZALNOŚĆ

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce, przez tego samego analityka nie może przekraczać:

20% odnośnie najwyższej wartości, dla zawartości bacytracyny cynku 5-25 mg/kg;

5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości większej niż 25-50 mg/kg;

10% odnośnie najwyższej wartości, dla zawartości powyżej 50 mg/kg.

2. OZNACZANIE FLAWOFOSFOLIPOLU POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy oznaczaniu flawofosfolipolu w paszach, koncentratach i premiksach. Dolna granica oznaczenia wynosi 1 mg/kg (1 ppm).

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana przy pomocy rozcieńczonego metanolu poprzez grzanie pod chłodnicą zwrotną. Po odwirowaniu, ekstrakt jest oczyszczany (jeśli konieczne) poprzez obróbkę żywicami jonowymiennymi i rozpuszczanie. Jego aktywność antybiotykowa jest oznaczana poprzez pomiar dyfuzji flawofosfolipolu w podłożu agaru posianym Staphylococcus aureus. Dyfuzja jest widoczna po tworzeniu się stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest bezpośrednio proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1 Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Staphylococcus Aureus na powierzchnię pożywki agarowej (4.1). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C, i ponawiać posiew co miesiąc na powierzchnię agaru.

3.2 Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej^a)

Odstawić dwie próbówki z kulturą macierzystą (3.1) i posiewać je co tydzień. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C.

Na 24 godziny przed oznaczeniem, należy posiać niniejszym przyrostem od dwóch do czterech próbówek zawierających wyciągi z pożywki (4.1). Inkubować 16-18 godzin w temperaturze 37 °C. Wykonać zawiesinę przyrostu w roztworze chlorku sodowego (4.3). Transmisja światła zawiesiny musi wynosić około 40%, zmierzona przy 578 nm. w 1 cm naczynku, w stosunku do roztworu chlorku sodowego (4.3).

4 POŻYWKI I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywkaa)

4.2. Odczynnik do oznaczania

4.2.1. Warstwa bazowab)

4.2.2. Warstwa nasienna

Tak jak w pkt. 4.1 z dodatkiem 2,0 g silikonowej emulsji przeciwpieniącejc)

4.3 0,4% (stężenie wagowe) roztwór chlorku sodowego: rozpuścić 4 g chlorku sodowego analitycznie czystego w wodzie i rozcieńczyć do 1 000 ml; poddać sterylizacji.

4.4 Czysty metanol

4.5 Metanol 50% (objętościowo): rozpuścić 500 ml metanolu (4.4) w 500 ml wody.

4.6 Metanol 80% (objętościowo): rozpuścić 800 ml metanolu (4.4) w 200 ml wody.

4.7 Trójhydroksymetyloaminometan analitycznie czysty.

4.8 1,5% (wagowo) roztwór metanolowy chlorku potasu: rozpuścić 1,5 g chlorku potasu analitycznie czystego w 20 ml wody, uzupełnić do 100 ml metanolem (4.4).

4.9 Wymieniacz kationowy: Dowex 50 W x 8, 20 do 50 mesh, forma Na (nr kat. Serva nr 41600) lub równoważny.

4.10 Wymieniacz anionowy: Dowex 1 x 2, 50 do 100 mesh, forma Cl (nr kat. Serva 41010) lub równoważny. Przed użyciem, należy trzymać 12-14 godzin w 80% metanolu (4,6)

4.11 Wełna szklana.

4.12 Papierek wskaźnikowy pH (pH 6,6-8,1).

4.13 Kwas askorbinowy.

4.14 Substancja podstawowa: flawofosfolipol o znanej aktywności.

5 APARATURA

5.1. Szklana próbówka dla chromatografii, wewnętrzna średnica: 9 mm długość: 150-200 mm, z kurkiem odcinającym przy zwężeniu na dole wraz z oszlifowanym połączeniem szklanym (do połączenia z wkraplaczem (5.2) na górze).

5.2. 250 ml wkraplacz z oszlifowanym połączeniem szklanym.

5.3. 250 ml kolba stożkowa z oszlifowanym połączeniem szklanym.

5.4. Chłodnica zwrotna z oszlifowanym połączeniem szklanym.

6 ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji podstawowej (4.14) w 50% metanolu (4.5) i rozpuścić, aby otrzymać roztwór podstawowy zawierając 100 μg flawofosfolipolu na mililitr. Roztwór ten przechowywany w kolbach z zatyczkami w temperaturze 4 °C jest stabilny przez maksymalnie dwa miesiące.

Powyższy roztwór podstawowy rozcieńczać stopniowo przy pomocy 50% metanolu (4.5) i przygotować następujące roztwory:

S₈ 0,2 μg/ml

S₄ 0,1 μg/ml

S₂ 0,05 μg/ml

S₁ 0,025 μg/ml

7 PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

7.1. Ekstrakcja

7.1.1. Koncentraty, premiksyi i pasze mineralne

Odważyć ilościowo próbkę 2,0-5,0 g, dodać około 150 mg kwasu askorbinowego (4.13). Ujednorodnić roztwór przy pomocy 150 ml 50% metanolu (4.5) w kolbie stożkowej (5.3), skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 przy pomocy około 400 mg trójhydroksymetyloaminometanu (4.7). Sprawdzić pH przy pomocy papierka wskaźnikowego (4.12). Odstawić na 15 minut, ponownie skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 trójhydroksymetyloaminometanem (4.7) i gotować przez 10 minut w chłodnicy zwrotnej stale mieszając. Zostawić do ostygnięcia, odwirować mieszaninę i zlać ekstrakt.

7.1.2. Pozostałe pasze

Odważyć ilościowo próbkę 5,0-30,0 g, zawierającą przynajmniej 30 μg flawofosfolipolu. Ujednorodnić roztwór przy pomocy 150 ml 50% metanolu (4.5) w kolbie stożkowej (5.3), skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 przy pomocy około 400 mg trójhydroksymetyloaminometanu (4.7). Sprawdzić pH przy pomocy papierka wskaźnikowego (4.12). Odstawić na 15 minut, skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 przy pomocy trójhydroksymetyloaminometanu (4.7) i gotować przez 10 minut w chłodnicy zwrotnej stale mieszając. Zostawić do ostygnięcia, odwirować mieszaninę i zlać ekstrakt.

7.2. Oczyszczanie (etap ten może być pominięty w przypadku koncentratów, premiksów i pasz mineralnych)

Zmieszać 110 ml ekstraktu z 11 g wymieniacza kationowego (4.9), gotować przez jedną minutę pod chłodnicą zwrotną, ciągle mieszając. Oddzielić wymieniacz kationowy przez odwirowanie lub odfiltrowanie. Wymieszać 100 ml ekstraktu ze 150 ml metanolu (4.4) i przechowywać roztwór 12-15 godzin w temperaturze 4 °C. Odfiltrować kłaczkowatą masę po ostygnięciu.

Dół szklanej probówki (5.1) zatkać zatyczką z wełny szklanej (4.11), wlać do probówki 5 ml wymieniacza anionowego (4.10) i przepłukać kolumnę 100 ml 80% metanolu (4.6). Używając lejka (5.2) przelać do kolumny co najmniej 100 ml odfiltrowanego roztworu, który powinien zawierać 16 μg flawofosfolipolu (200 ml dla próbki 30 g paszy przy 1 ppm). Gdy zachodzi potrzeba, przed wlaniem do kolumny, rozcieńczyć filtrat 80% metanolem (4.6), aby uzyskać zakładaną zawartość flawofosfolipolu wynoszącą 16 μg/100 ml. Wielkość przepływu ustawić na 2 ml na minutę. Odrzucić odciek. Następnie przepłukać kolumnę 50 ml 80% metanolem (4.6) i odrzucić odciek.

Wymyć flawofosfolipol przy pomocy roztworu metanolowego chlorku potasu (4.8) utrzymując przepływ około 2 ml na minutę. Zebrać 50 ml odcieku w szklanej kolbie miarowej, dodać 30 ml wody i wymieszać. Roztwór ten zawiera 0.2 μg/ml (= U₈) flawofosfolipolu.

7.3. Roztwory do oznaczania

Gdy zachodzi potrzeba (tj. gdy etap oczyszczania został pominięty), rozcieńczyć ekstrakt uzyskany w pkt. 7.1.1 przy pomocy 50% metanolu (4.5), aby uzyskać planowaną zawartość flawofosfolipolu w wysokości 0,2 μg/ml (U₈).

Z roztworu U₈ przygotować roztwór U₄ (przewidywana zawartość: 0,1 μg/ml), U₂ (przewidywana zawartość: 0,05 μg/ml) oraz U₁ (przewidywana zawartość: 0,025 μg/ml) na drodze kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy pomocy 50% metanolu (4.5).

8. PROCEDURA OZNACZANIA

8.1. Posiew czynnika do oznaczania

Należy posiać czynnik do oznaczania (4.2.2) przy pomocy zawiesiny bakteryjnej (3.2) w temperaturze około 50 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z czynnikiem do oznaczania (4.2.2) ustalić ilość zawiesiny bakteryjnej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących przy różnych stężeniach flawofosfolipolu (około 30 ml/litr).

8.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U₈, U₄, U₂, U₁). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorzec muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. Mając to na uwadze, należy wybrać odpowiednio duże płytki, które zmieszczą przynajmniej osiem otworów o średnicy 10-13 mm i nie mniej niż 30 mm między środkami, które mają być zrobione w podłożu agaru. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm wysokości.

Do płytek należy wlać odpowiednią ilość czynnika (4.2.1), aby uzyskać 1,5 mm warstewkę (45 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Zostawić poziomo do wyrównania powierzchni, a następnie pokryć ilością czynnika (4.2.2) posianego zgodnie z pkt. 8.1, aby uzyskać warstwę o grubości 1 mm (30 ml dla płytki o średnicy 200 mm). Ponownie zostawić w pozycji poziomej, nawiercić otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów do oznaczania i wzorcowych (od 0,10-0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą).

Zastosować każde stężenie przynajmniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.

8.3. Inkubacja

Inkubować płytki 16-18 godzin w temperaturze 28-30 °C.

9. OCENA

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności od średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL) stosując wzór:

a) SL =

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując wzór:

b) SH =

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH) wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości S1,S2, S4 i S8 wartości U1, U2,U4 i U6.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punktyt o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej zgodności, dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10% od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo U1 i S1 lub U8 i S8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie, łączące punkty o najlepszej zgodności:

a’) SL = lub

b’) SH = lub

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności, powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. To, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log. A) za pomocą jednego z następujących wzorów.

Dla czterech poziomów:

c) log. A =

Dla trzech poziomów:

d) log. A =

lub

d’) log. A =

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana x aktywność względna

W przypadku gdy linie nie są równoległe, należy powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe, należy obliczyć logarytm aktywności względnej (log. A) stosując wzór c). Uzyskany wynik musi być jednak wzięty pod uwagę jako wynik przybliżony, co powinno zostać odnotowane w raporcie końcowym.

10. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

0,5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości flawofosfolipolu 1-2 mg/kg;

25% względem najwyższej wartości dla zawartości większej niż 2 i do 10 mg/kg;

20% względem najwyższej wartości dla zawartości większej niż 10 i do 25 mg/kg;

5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych dla zawartości większej niż 25 i do 50 mg/kg;

10% względem najwyższej wartości dla zawartości powyżej 50 mg/kg.

3. OZNACZANIE PIERWIASTKÓW ŚLADOWYCH ŻELAZA, MIEDZI, MANGANU I CYNKU

1. CEL I ZAKRES

Metoda pozwala na oznaczenie pierwiastków śladowych żelaza, miedzi, manganu i cynku w paszach. Najniższymi granicami oznaczeń są:

żelazo (Fe): 20 mg/kg

miedź (Cu): 10 mg/kg

mangan (Mn): 20 mg/kg

cynk (Zn): 20 mg/kg

2. ZASADA

Próbka jest umieszczana w roztworze kwasu solnego po rozłożeniu ewentualnych części organicznych. Oznaczane są takie pierwiastki jak żelazo, miedź, mangan i cynk, po odpowiednim rozcieńczeniu, przy użyciu spektrofotometrii absorpcyjnej atomowej.

3. ODCZYNNIKI

Uwagi wstępne

Dla przygotowania odczynników i roztworów analitycznych użyć wody, wolnej od kationów pierwiastków, które mają być oznaczane, uzyskanej albo poprzez podwójną destylację wody w szkle borokrzemianowym lub kwarcowym albo wody uzdatnionej dwukrotnie przy pomocy żywicy kationitowej.

Odczynniki muszą być przynajmniej czystości analitycznej (a.p.). Sprawdzenie czy odczynniki są wolne od pierwiastka musi być wykonane ślepą próbą. Jeśli konieczne, odczynniki należy dalej oczyszczać.

W miejsce wzorcowych roztworów opisanych poniżej, można użyć wzorcowych roztworów dostępnych w handlu, pod warunkiem że mają one gwarancję i zostały sprawdzone przed użyciem.

3.1. Kwas solny czystości analitycznej (gęstość: 1,19)

3.2. Kwas solny czystości analitycznej (6 N)

3.3. Kwas solny czystości analitycznej (0,5 N)

3.4. 38-40% kwas fluorowodorowy (objętościowo) z zawartością żelaza poniżej 1 mg Fe na litr oraz pozostałość po odparowaniu poniżej 10 mg (w postaci siarczanu) na litr.

3.5. Kwas siarkowy czystości analitycznej (stężenie: 1,84)

3.6. Nadtlenek wodoru czystości analitycznej (około 100 objętości tlenu (30% wagowo).

3.7. Wzorcowy roztwór żelaza (1 000 μg Fe/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g drutu żelaznego czystości analitycznej w 200 ml 6 N kwasu solnego (3.2), dodać 16 ml nadtlenku wodoru (3.6) oraz uzupełnić do objętości jednego litra wodą.

3.7.1. Wzorcowy roboczy roztwór żelaza (100 μg Fe/ml) przygotowany poprzez rozcieńczenie wzorcowego roztworu (3.7) przy pomocy 1 + 9 wody.

3.8. Wzorcowy roztwór miedzi (1 000 μg Cu/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g miedzi sproszkowanej czystości analitycznej w 25 ml 6 N kwasu solnego (3.2), dodać 5 ml nadtlenku wodoru (3.6) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą.

3.8.1. Wzorcowy roboczy roztwór miedzi (10 μg Cu/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (3.8) przy pomocy 1 + 9 wody i uzyskany roztwór ponownie rozcieńczony przy pomocy 1 + 9 wody.

3.9. Wzorcowy roztwór manganu (1 000 μg Mn/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g sproszkowanego manganu czystości analitycznej w 25 ml 6 N kwasu solnego (3.2), dodać 5 ml nadtlenku wodoru (3.6) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą.

3.9.1. Wzorcowy roboczy roztwór manganu (10 μg Mn/ml) przygotowany poprzez rozcieńczenie wzorcowego roztworu (3.9) przy pomocy 1 + 9 wody, a otrzymany roztwór ponownie rozcieńczony 1 + 9 wody.

3.10. Wzorcowy roztwór cynku (1 000 μg Zn/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g taśmy lub folii cynkowej czystości analitycznej w 25 ml 6 N kwasu solnego (3.2) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą.

3.10.1 Wzorcowy roboczy roztwór cynku (10 μg Zn/ml) przygotowany poprzez rozcieńczenie wzorcowego roztworu (3.10) przy pomocy 1 + 9 wody, a otrzymany roztwór ponownie rozcieńczony 1 + 9 wody.

3.11. Roztwór chlorku lantanowego, przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 12 g tlenku lantanu w 150 ml wody, dodać 100 ml 6 N kwasu solnego (3.2) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą.

4. APARATURA

4.1. Piec muflowy z regulacją temperatury i rejestratorem.

4.2. Wyroby szklane musza być wykonane z odpornego borokrzemianowego szkła i zaleca się użyć aparatury, która jest używana wyłącznie do oznaczania pierwiastków śladowych.

4.3. Tygiel platynowy i jako opcja tygiel kwarcowy.

4.4. Spektrofotometr absorpcyjny atomowy spełniający wymagania metody odnośnie czułości i dokładności w wymaganym zakresie.

5. PROCEDURA

5.1. Próbki zawierająca części organiczne

5.1.1. Spopielanie i przygotowywanie roztworu do analizy*)

(i) Umieścić 5-10 g próbkę, zważoną z dokładnością do 0,2 g, w kwarcowym lub platynowym tyglu (4.3) (patrz Uwaga b), wysuszyć w piecu w temperaturze 105 °C i włożyć tygiel do zimnego pieca muflowego (4.1). Zamknąć piec (patrz uwaga c) i stopniowo podwyższać temperaturę do 450-475 °C przez około 90 minut. Osiągniętą temperaturę należy utrzymywać 4-16 godzin (np. przez noc) w celu usunięcia materiałów z zawartością węgla, a następnie otworzyć piec i pozwolić mu wystygnąć (patrz Uwaga d)).

Przemyć tygiel przy pomocy około 5 ml kwasu solnego (3.1) i dodawać kwas powoli i ostrożnie do zlewki (może zajść gwałtowna reakcja z powodu powstania CO₂). Dodawać kwas solny (3.1) kroplami i mieszać dopóki roztwór nie przestanie burzyć się. Odparować do sucha, od czasu do czasu mieszając pałeczką szklaną.

Następnie dodać 15 ml 6N kwasu solnego (3.2) do pozostałości, po czym dodać około 120 ml wody. Należy mieszać pałeczką szklaną, która musi pozostać w zlewce, a zlewkę należy przykryć szkiełkiem zegarkowym. Delikatnie doprowadzić do stanu wrzenia i utrzymywać temperaturę wrzenia dopóki będzie widać, że więcej popiołu nie może się już rozpuścić. Odfiltrować przy sączka bezpopiołowego i zebrać filtrat w 250 ml kolbie pomiarowej. Umyć zlewkę i filtr przy pomocy 5 ml gorącego 6 N kwasu solnego (3.2) i dwukrotnie wrzącą wodą. Kolbę pomiarową należy napełnić aż do kreski wodą (stężenie kwasu solnego około 0,5 N).

(ii) Jeśli pozostałość na filtrze jest czarna (węgiel), próbkę z powrotem włożyć do pieca i spopielić ponownie w temperaturze 450-475 °C. Proces spopielania wymagający kilku godzin (od trzech do pięciu godzin) jest zakończony, gdy popiół jest biały lub prawie biały. Rozpuścić pozostałość przy użyciu około 2 ml kwasu solnego (3.1), odparować do sucha i dodać 5 ml 6N kwasu solnego (3.2) Podgrzać, odfiltrować roztwór do kolby pomiarowej i napełnić kolbę aż do kreski wodą (stężenie kwasu solnego około 0,5 N).

Uwagi:

a) Przy oznaczaniu pierwiastków śladowych ważne jest, aby wystrzegać się ryzyka zanieczyszczenia szczególnie cynkiem, miedzią i żelazem. Z tego powodu sprzęt używany do przygotowania próbek nie może zawierać tych metali.

Aby uniknąć ogólnego ryzyka zanieczyszczeń, należy pracować w środowisku bezpyłowym, przy użyciu skrupulatnie wyczyszczonego sprzętu i dokładnie wymytych wyrobów szklanych. Oznaczanie cynku jest procesem szczególnie wrażliwym na wiele rodzajów zanieczyszczeń np. z wyrobów szklanych, odczynników, pyłu itd.

b) Waga próbki, która ma być spopielona, jest obliczana na podstawie przybliżonej zawartości pierwiastków śladowych w paszy w stosunku do czułości użytego spektrofotometru. Dla pewnych pasz zawierających niewielkie ilości pierwiastków śladowych, może zajść konieczność rozpoczęcia oznaczania od próbek 10-20 g i ostateczny roztwór uzupełnić do objętości tylko 100 ml.

c) Proces spopielania musi przeprowadzony w zamkniętym piecu bez wdmuchiwania powietrza lub tlenu.

d) Temperatura wskazywana na pirometrze nie może przekraczać 475 °C.

5.1.2. Oznaczanie przy użyciu spektrofotometru

5.1.2.1. Przygotowanie roztworów do wzorcowania

Dla każdego z pierwiastków, które mają być oznaczane, należy przygotować, przy użyciu standardowych roztworów roboczych opisanych w pkt. 3.7.1., 3.8.1., 3.9.1. oraz 3.10.1, zakres roztworów do wzorcowania, przy czym każdy roztwór do wzorcowania posiada stężenie kwasu solnego około 0,5 N i (w przypadku żelaza, manganu i cynku) stężenie chlorku lantanu równoważne 0,1% La (wagowo). Wybrane stężenia pierwiastków śladowych muszą mieścić się w zakresie czułości użytego spektrofotometru. Poniższe tabele, pokazują jako przykład, skład typowych zakresów roztworów do wzorcowania; w zależności jednak od rodzaju i czułości użytego spektrofotometru może okazać się konieczny wybór innych stężeń.

Żelazo

μg Fe /ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml roboczego roztworu wzorcowego (3.7.1)
(1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
+ ml 6 N HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) oraz uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

Miedź

μg Cu /ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	0,1
ml roboczego roztworu wzorcowego (3.8.1)
(1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
+ ml 6 N HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8
+ uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

Mangan

μg Mn /ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	0,1
ml roboczego roztworu wzorcowego (3.9.1)
(1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
+ ml 6 N HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) oraz uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

Cynk

μg Zn /ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml roboczego roztworu wzorcowego (3.10.1)
(1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
+ ml 6 N HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) oraz uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

5.1.2.2. Przygotowanie roztworu do analizy

W celu oznaczenia miedzi, przygotowany roztwór z pkt. 5.1.1 używa się zwykle bezpośrednio. Jeśli zachodzi konieczność przybliżenia stężenia do zakresu roztworu do wzorcowania, podwielokrotna porcja może być wlana przy pomocy pipetki do 100 ml kolby miarowej i uzupełniona do kreski 0,5 N kwasem solnym (3.3).

W celu oznaczenia żelaza, manganu i cynku, odpipetować podwielokrotną porcję roztworu przygotowanego zgodnie z pkt. 5.1.1. do 100 ml kolby miarowej i uzupełnić do kreski 0,5 N kwasem solnym (3.3) (patrz również pkt. 8 „Obserwacje”).

5.1.2.3. Ślepa próba

Ślepa próba musi zawierać wszystkie zalecane kroki procedury z pominięciem próbki.

Nie wolno jest używać w ślepej próbie roztworu do wzorcowania „0”.

5.1.2.4. Pomiar absorpcji atomowej

Zmierzyć absorpcję atomową roztworów wzorcowych oraz roztworu analizowanego przy użyciu utleniającego płomienia acylenowo - powietrznego o następujących długościach fali:

Fe : 248,3 nm

Cu : 324,8 nm

Mn : 279,5 nm

Zn : 213,8 nm

Każdy pomiar przeprowadzić cztery razy.

5.2. Pasze mineralne

Jeśli próbka nie zawiera cząstek organicznych to wcześniejsze spopielanie nie jest konieczne. Należy postępować zgodnie z pkt. 5.1.1. (i) poczynając od akapitu drugiego. Odparowanie z kwasem fluorowodorowym można pominąć.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Przy użyciu krzywej wzorcowania, należy obliczyć stężenie pierwiastków śladowych w roztworze do analizy i zapisać wynik w miligramach pierwiastka śladowego na kilogram próbki (ppm).

7. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka nie powinna przekraczać:

-5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości pierwiastka śladowego do 50 mg/kg;

-10% wyższej wartości zawartości pierwiastka śladowego w przedziale 50-100 mg/kg;

-10 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości pierwiastka śladowego 100-200 mg/kg;

-5% wyższej wartości zawartości pierwiastka śladowego w przedziale 50-200 mg/kg;

8. OBSERWACJA

Obecność dużych ilości fosforanów przeszkadza w oznaczeniu żelaza, manganu i cynku. Takie zakłócanie wyników oznaczeń musi być skorygowane poprzez dodanie roztworu chlorku lantanu (3.11). Jeśli jednak w próbce stosunek wagowy , to dodanie roztworu chlorku lantanu (3.11) do roztworu do analizy i do roztworów wzorcowych można pominąć.