METODA JEDNOKIERUNKOWA CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ

Cel i zakres metody

Metoda ta umożliwia określenie zawartości aflatoksyny B₁ w następujących paszach: orzechach ziemnych, koprze, siemieniu lnianym, soji, sezamie indyjskim, makuchach z palmy babbasu i kiełkach kukurydzy, roślinach zbożowych i produktach zbożowych, mączce grochowej, pulpie ziemniaczanej i skrobi. Dolna granica oznaczania wynosi 0,01 mg/kg (10 ppb).

Jeśli obecność substancji interferencyjnych uniemożliwia określenie, analizę trzeba rozpocząć od nowa stosując metodę B (dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa).

Zasada

Próbka jest ekstrahowana chloroformem. Ekstrakt jest filtrowany, pobierana jest odpowiednią porcja filtratu i oczyszczana metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Eluat jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana ponownie w określonej objętości chloroformu lub mieszaniny benzenu i acetonitrylu. Odpowiednia porcja tego roztworu jest poddawana chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Zawartość aflatoksyny B₁ określana jest metodą wizualną lub fluorodensytometryczną, po naświetleniu chromatogramu promieniami ultrafioletowymi, przez porównanie ze znanymi ilościami wzorcowej aflatoksyny B₁. Identyczność aflatoksyny B₁ ekstrahowanej z paszy musi zostać potwierdzona wskazaną procedurą.

Odczynniki

Notabene: Wszystkie odczynniki muszą być „odczynnikami o czystości analitycznej”, chyba że określono inaczej.

Aceton.

Chloroform, stabilizowany 96% etanolem (v/v) w ilości 0,5-1,0%.

N - heksan.

Metanol.

Bezwodny eter etylu wolny od peroksydów.

Mieszanina benzenu i acetonitrylu w stosunku 98:2 (v/v).

Mieszanina chloroformu (ppkt 3.2) i metanolu (ppkt 3.4) w stosunku 97:3 (v/v).

Żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej; wielkość cząstek 0,05-0,20 mm.

Wata absorpcyjna odtłuszczona chloroformem lub wata szklana.

Bezwodny, granulowany siarczan sodu.

Gaz obojętny, np. azot.

1 N kwas solny.

50% (v/v) kwas siarkowy.

Ziemia okrzemkowa wymyta w kwasie.

Żel krzemionkowy G - HR lub równoważny do chromatografii cienkowarstwowej.

Roztwór wzorcowy, zawierający około 0,1 mg aflatoksyny B₁ na 1,0 ml chloroformu (ppkt 3.2) lub mieszaniny benzenu i acetonitrylu (ppkt 3.6), sporządzony i sprawdzony zgodnie z sekcją 7.

Roztwór wzorcowy do badania jakościowego, zawierający około 0,1 mg aflatoksyny B₁ i B₂ na 1,0 ml chloroformu (ppkt 3.2) lub mieszaniny benzenu i acetonitrylu (ppkt 3.6). Powyższe stężenia podane są orientacyjnie. Należy je dobrać tak, aby uzyskać to samo natężenie fluorescencji dla obydwu aflatoksyn.

Rozpuszczalniki wywołujące:

Chloroform (ppkt 3.2) i aceton (ppkt 3.1) w stosunku 9:1 (v/v), zbiornik nienasycony;

Eter etylu (ppkt 3.5), metanol (ppkt 3.4) i woda w stosunku 96:3:1 (v/v/v), zbiornik nienasycony;

Eter etylu (ppkt 3.5), metanol (ppkt 3.4) i woda w stosunku 94:4,5:1,5 (v/v/v), zbiornik nasycony;

Chloroform (ppkt 3.2) i metanol (ppkt 3.4) w stosunku 96:4 (v/v), zbiornik nasycony;

Chloroform (ppkt 3.2) i metanol (ppkt 3.4) w stosunku 97:3 (v/v), zbiornik nasycony;

Aparatura

Młynek - mieszarka.

Wytrząsarka lub mieszadło magnetyczne.

Bibuły do filtra harmonijkowego Schleicher i Schüll nr 588 lub równoważne, o średnicy 24 cm

Rurka szklana (o średnicy wewn. 22 mm i długości 300 mm) do chromatografii z korkiem z policzterofluoroetylenu i 250-mililitrowym zbiornikiem.

Obrotowa parownica próżniowa z okrągłodenną kolbą o pojemności 500 ml.

Kolby stożkowe o pojemności 500 ml ze szlifowanymi korkami szklanymi.

Aparatura do chromatografii cienkowarstwowej.

Płytki szklane 200 × 200 mm do chromatografii cienkowarstwowej przygotowane w następujący sposób (podane ilości wystarczają do pokrycia 5 płytek): umieścić 30 g żelu krzemionkowego G - HR (ppkt 3.15) w stożkowej kolbie. Dodać 60 ml wody, kolbę zatkać i przez minutę wytrząsać. Rozprowadzić zawiesinę na płytkach tak, aby uzyskać równomierną warstwę o grubości 0,25 mm. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu, a następnie przechowywać w eksykatorze z żelem krzemionkowym. Bezpośrednio przed użyciem aktywować płytki trzymając je w piecu w temperaturze 110 °C przez godzinę.

Płytki nadają się do użycia, jeśli dają wyniki podobne do wyników uzyskanych z płytek przygotowanych w opisany wyżej sposób.

Lampa UV o długości fali 360 nm. Natężenie napromieniania musi umożliwiać wyraźne odróżnianie na płytce TLC plamki aflatoksyny B₁ o masie 1 ng z odległości 10 cm od lampy.

Probówki miarowe o pojemności 10 ml z korkami z polietylenu.

Spektrofotometr UV.

Fluorodensytometr (nieobowiązkowo).

Procedura

5.1 Przygotowanie próbki (patrz „Uwagi”, część C pkt 1)

Zemleć próbkę tak, aby w całości przechodziła przez sito o wielkości oczka 1 mm (zgodnie z zaleceniem ISO R 565).

Ekstrakcja

Umieścić 50 g zmielonej, jednolitej próbki w stożkowej kolbie o pojemności 500 ml (ppkt 4.6). Dodać 25 g ziemi okrzemkowej (ppkt 3.14), 25 ml wody i 250 ml chloroformu (ppkt 3.2). Zatkać kolbę, wstrząsać lub mieszać przez 30 minut przy użyciu urządzenia (ppkt 4.2) i przefiltrować przez bibułowy filtr harmonijkowy (pakt 4.3). Odrzucić pierwsze 10 ml filtratu, a następnie zebrać 50 ml.

Oczyszczanie na kolumnie

Do dolnego końca rurki chromatograficznej (ppkt 4.4) włożyć korek z waty lub wełny szklanej (ppkt 3.9), napełnić dwietrzecie rurki chloroformem (ppkt 3.2) i dodać 5 g siarczanu sodu (ppkt 3.10).

Sprawdzić, czy górna powierzchnia warstwy siarczanu sodu jest płaska, następnie dodać w małych porcjach 10 g żelu krzemionkowego (ppkt 3.8). Po każdej porcji dodania starannie zamieszać, aby usunąć bąbelki powietrza. Pozostawić na 15 minut do odstania, a następnie ostrożnie dodać 15 g siarczanu sodu (ppkt 3.10). Pozwolić cieczy opaść tak, aby znajdowała się dokładnie nad górną powierzchnią warstwy siarczanu sodu.

Wymieszać 50 ml ekstraktu, zebranego w ppkt. 5.2, ze 100 ml pakt - heksanu (ppkt 3.3) i ilościowo przenieść mieszaninę na kolumnę. Pozwolić cieczy opaść tak, aby znajdowała się dokładnie nad górną powierzchnią warstwy siarczanu sodu. Zlać popłuczyny. Następnie dodać 100 ml eteru etylu (ppkt 3.5) i ponownie pozwolić cieczy opaść do górnej powierzchni warstwy siarczanu sodu. Podczas tych czynności pilnować, żeby tempo przepływu wynosiło 8-12 ml/min. i żeby kolumna nie pracowała na sucho. Zlewać ciecz wypływającą. Następnie wymyć kolumnę 150 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (ppkt 3.7) i zebrać całość eluatu.

Odparować eluat prawie do suchości w wyparce obrotowej (ppkt 4.5), w temperaturze nie przekraczającej 50 °C i w strumieniu gazu obojętnego (pakt 3.11). Pozostałość przenieść ilościowo, przy pomocy chloroformu (ppkt 3.2) lub mieszaniny chloroformu z acetonitrylem (ppkt 3.6), do 10- mililitrowej probówki miarowej (ppkt 4.10). zagęścić roztwór pod strumieniem gazu obojętnego (ppkt 3.11), a następnie uzupełnić objętość do 2 ml chloroformem (ppkt 3.2) lub mieszaniną chloroformu z acetonitrylem (ppkt 3.6).

Chromatografia cienkowarstwowa

Nanieść punktowo na płytkę TLC (ppkt 4.8), w odległości 2 cm od dolnej krawędzi, w odstępach 2 cm, podane poniżej objętości roztworu wzorcowego i ekstraktu:

10, 15, 20, 30 i 40 µl wzorcowego roztworu aflatoksyny B₁ (ppkt 3.16);

10 µl ekstraktu uzyskanego w ppkt. 5.3, i nakładanego na ten sam punkt,

20 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16);

10 i 20 µl ekstraktu uzyskanego w ppkt. 5.3.

Wywołać chromatogram w ciemności jednym z rozpuszczalników wywołujących (ppkt 3.18). Wyboru rozpuszczalnika należy dokonać wcześniej nanosząc na płytkę 25 ml jakościowego roztworu wzorcowego (ppkt 3.17) i sprawdzając, czy aflatoksyny B₁ i B₂ są całkowicie oddzielone po wywołaniu.

Odczekać aż rozpuszczalniki odparują w ciemności, a następnie naświetlić płytkę promieniami ultrafioletowymi umieszczając ją w odległości 10 cm od lampy (ppkt 4.9). Miejsca z aflatoksyną B₁ świecą na niebiesko.

Określenia ilościowe

Określić wizualnie lub metodą fluorodensytometryczną w opisany poniżej sposób.

Pomiary wizualne

Określić ilość aflatoksyny B₁ w ekstrakcie porównując natężenie fluorescencji plamki ekstraktu z natężeniem fluorescencji plamki roztworu wzorcowego. W razie potrzeby interpolować. Fluorescencja uzyskana w wyniku nałożenia ekstraktu na roztwór wzorcowy musi być intensywniejsza niż pochodząca od 10 ml ekstraktu i nie może być widoczna więcej niż jedna plamka. Jeśli natężenie fluorescencji wywołane przez 10 ml ekstraktu jest większe niż wywołane przez 40 ml roztworu wzorcowego, należy rozcieńczyć ekstrakt 10- krotnie lub 100- krotnie chloroformem (ppkt 3.2) lub mieszaniną benzenu i acetonitrylu (ppkt 3.6) przed ponownym poddaniem go chromatografii cienkowarstwowej.

Pomiary metodą fluorodensytometryczną

Zmierzyć natężenie fluorescencji plamki aflatoksyny B₁ fluorodensytometrem (ppkt 4.12) przy długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 443 nm. Określić ilość aflatoksyny B₁ w plamkach ekstraktu porównując natężenie fluorescencji polamki ekstraktu z natężeniem fluorescencji plamki wzorcowej aflatoksyny B₁.

Potwierdzenie identyczności aflatoksyny B₁

Potwierdzić identyczność aflatoksyny B₁ w ekstrakcie przeprowadzając opisane poniżej procesy.

Obróbka kwasem siarkowym

Rozpylić kwas siarkowy (ppkt 3.13) na chromatogram uzyskany w ppkt. 5.4. Fluorescencja plamek aflatoksyny B₁—musi się zmienić z niebieskiej na żółtą pod wpływem napromieniania ultrafioletem.

Dwukierunkowa chromatografia z utworzeniem aflatoksyny B₁—półacetalu (aflatoksyny B_2a)

Notabene: Poniższe operacje należy wykonać przestrzegając dokładnie schematu na rysunku 3.

Nanoszenie roztworów

Zarysować dwie linie proste na płytce (ppkt 4.8) równolegle do dwóch sąsiednich krawędzi (w odległości 6 cm od każdej krawędzi), aby ograniczyć migrację czołowych części rozpuszczalnika. Pipetami kapilarnymi lub mikrostrzykawkami nanieść punktowo na płytkę następujące roztwory:

w pkt. A: objętość oczyszczonego ekstraktu próbki, uzyskanego w ppkt. 5.3, zawierającą około 2,5 nm aflatoksyny B₁;

w pkt. B i C: 25 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16).

Wywoływanie

Wywoływać w ciemności chromatogram w kierunku I stosując rozpuszczalnik wywołujący (ppkt 3.18.1) (1- centymetrowa warstwa w zbiorniku nienasyconym), dopóki czoło rozpuszczalnika nie osiągnie linii granicznej.

Wyjąć płytkę ze zbiornika i pozostawić w ciemności do wyschnięcia na pięć minut, w temperaturze otoczenia. Następnie rozpylić na płytkę kwas solny (pakt 3.12) wzdłuż pasa o wysokości 2,5 cm, pokrywającego pkt. A i B (zakreskowany obszar na rysunek 3), dopóki nie ściemnieje, zakrywając pozostałą część płytki szklaną szybką. Odczekać 10 minut na przereagowanie kwasu w ciemności i wysuszyć płytkę w strumieniu powietrza, w temperaturze otoczenia.

Następnie, wywoływać w ciemności chromatogram w kierunku II stosując rozpuszczalnik wywołujący (ppkt 3.18.1) (1- centymetrowa warstwa w zbiorniku nienasyconym), dopóki czoło rozpuszczalnika nie osiągnie linii granicznej. Wyjąć płytkę ze zbiornika i pozostawić w ciemności do wyschnięcia, w temperaturze otoczenia.

Interpretacja chromatogramu

Zbadać chromatogram w świetle ultrafioletowym (ppkt 4.9) i sprawdzić pod kątem następujących właściwości:

Pojawienie się niebieskiej fluoryzującej plamki aflatoksyny B₁ pochodzącej z roztworu wzorcowego, nałożonego w pkt. C (migracja w kierunku I).

Pojawienie się niebieskiej fluoryzującej plamki nieprzereagowanej (z kwasem solnym) aflatoksyny B₁ i intensywniej fluoryzującej na niebiesko plamki aflatoksyny B₁ - półacetalu pochodzących z roztworu wzorcowego, nałożonego w pkt. B (migracja w kierunku II).

Pojawienie się plamek odpowiadających plamkom opisanym w lit. b) pochodzących z roztworu wzorcowego, nałożonego w pkt. A. Położenie tych plamek jest określone najpierw przez odległość migracji aflatoksyny B₁ od pkt. A w kierunku I (taka sama, jak odległość przebyta przez wzorzec nałożony w pkt. C), a następnie przez odległości migracji aflatoksyny B₁ - półacetalu stamtąd w kierunku II (takie same, jak odległości przebyte przez wzorzec nałożony w pkt. B). Natężenia fluorescencji plamek półacetalu pochodzących z ekstraktu i z roztworu wzorcowego nałożonego w pkt. B powinny pasować do siebie.

Obliczanie wyników

Z pomiarów wizualnych

Zawartość aflatoksyny B₁ w mg na kg próbki (ppb) jest wyrażona wzorem:

gdzie:

Y i X są odpowiednio objętościami w µl wzorcowego roztworu aflatoksyny B₁ (3.16) i ekstraktu o podobnym natężeniu fluorescencji;

S = stężenie wyrażone w µg aflatoksyny B₁ na ml roztworu wzorcowego (ppkt 3.16);

V = końcowa objętość ekstraktu w µl, umożliwiająca ewentualne niezbędne rozcieńczenie;

W = masa próbki w g odpowiadająca objętości ekstraktu poddanego oczyszczeniu na kolumnie.

Z pomiarów metodą fluorodensytometryczną

Zawartość aflatoksyny B₁ w mg na kg próbki jest wyrażona wzorem:

gdzie:

Y = objętość ekstraktu naniesionego na płytkę, w µl (10 lub 20 µl);

S = ilość aflatoksyny B₁ w ng w plamce ekstraktu (proporcjonalna do pobranej wartości Y);

V = końcowa objętość ekstraktu w µl, umożliwiająca ewentualne niezbędne rozcieńczenie;

W = masa próbki w g odpowiadająca objętości ekstraktu poddanego oczyszczeniu na kolumnie.

Sporządzanie i sprawdzanie roztworu wzorcowego (ppkt 3.16)

Określenie stężenia aflatoksyny B₁

Sporządzić wzorcowy roztwór aflatoksyny B₁ w chloroformie (ppkt 3.2) lub mieszaninie benzenu i acetonitrylu (ppkt 3.6) o stężeniu 8-10 mg/ml. Przy pomocy spektrofotometru (ppkt 4.11) określić widmo absorpcyjne w zakresie długości fali 330-370 nm.

Zmierzyć gęstość optyczną (A) przy długości fali 363 nm w przypadku roztworu chloroformu lub 348 nm w przypadku roztworu w mieszaninie benzenu i acetonitrylu.

Z poniższych wzorów obliczyć stężenie aflatoksyny B₁ wyrażone w mg na ml roztworu:

dla roztworu chloroformu;

dla roztworu w mieszaninie benzenu i acetonitrylu.

Rozcieńczyć odpowiednio, z dala od światła dziennego, aby uzyskać roboczy roztwór wzorcowy o stężeniu aflatoksyny B₁ około 0,1 mg/ml. Trwałość roztworu wynosi dwa tygodnie pod warunkiem, że jest przechowywany w lodówce w temperaturze 4 °C.

Sprawdzanie czystości chromatograficznej

Nanieść punktowo na płytkę (ppkt 4.8) 5 ml wzorcowego roztworu aflatoksyny B₁ zawierającego 8-10 mg/ml (ppkt 7.1). Wywołać chromatogram zgodnie z ppkt. 5.4. W świetle ultrafioletowym na chromatogramie powinna być widoczna tylko jedna plamka i nie powinna być widoczna żadna fluorescencja w pierwotnej strefie naniesienia.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych określeń przeprowadzonych na tej samej próbce, przez tę samą osobę, nie powinna przekraczać:

25% największego uzyskanego pomiaru dla zawartości aflatoksyny B₁ 10-20 µg/kg;

5 mg wartości bezwzględnej dla zawartości aflatoksyny B₁ 20-50 µg/kg;

10% największego uzyskanego pomiaru dla zawartości aflatoksyny B₁ powyżej 50 µg/kg.

Odtwarzalność

Patrz „Uwagi”, część C pkt 2.

METODA KIERUNKOWEJ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ

Cel i zakres metody

Metoda ta umożliwia określenie zawartości aflatoksyny B₁ w paszach nie objętych zakresem metody A. Dolna granica oznaczania wynosi 0,01 mg/kg (10 ppb). Metody tej nie stosuje się do pasz zawierających pulpę z owoców cytrusowych.

Zasada

Próbka jest ekstrahowana chloroformem. Ekstrakt jest filtrowany, pobierana jest odpowiednia porcja filtratu i oczyszczana metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Eluat jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana ponownie w określonej objętości chloroformu lub mieszaniny benzenu i acetonitrylu. Odpowiednia porcja tego roztworu jest poddawana dwukierunkowej chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Zawartość aflatoksyny B₁ określana jest metodą wizualną lub fluorodensytometryczną, po napromienieniu chromatogramu ultrafioletem, poprzez porównanie ze znanymi ilościami wzorcowej aflatoksyny B₁. Identyczność aflatoksyny B₁ ekstrahowanej z paszy musi zostać potwierdzona wskazaną procedurą.

Odczynniki

Notabene: Wszystkie odczynniki muszą być „odczynnikami o czystości analitycznej”, chyba że określono inaczej.

Aceton.

Chloroform, stabilizowany 96% etanolem (v/v) w ilości 0,5-1,0%.

N - heksan.

Metanol.

Bezwodny eter etylu wolny od peroksydów.

Mieszanina benzenu i acetonitrylu w stosunku 98:2 (v/v).

Mieszanina chloroformu (ppkt 3.2) i metanolu (ppkt 3.4) w stosunku 97:3 (v/v).

Żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej; wielkość cząstek 0,05-0,20 mm.

Wata absorpcyjna odtłuszczona chloroformem lub wata szklana.

Bezwodny, granulowany siarczan sodu.

Gaz obojętny, np. azot.

1 N kwas solny.

Ziemia okrzemkowa wymyta w kwasie.

Żel krzemionkowy G - HR lub równoważny do chromatografii cienkowarstwowej.

Rozpuszczalniki wywołujące.

Eter etylu (ppkt 3.5), metanol (ppkt 3.4) i woda w stosunku 94:4,5:1,5 (v/v/v), zbiornik nasycony.

Chloroform (ppkt 3.2), aceton (ppkt 3.1) w stosunku 9:1 (v/v), zbiornik nienasycony.

Roztwór wzorcowy, zawierający około 0,1 µg aflatoksyny B₁ na 1,0 ml chloroformu (ppkt 3.2) lub mieszaniny benzenu i acetonitrylu (ppkt 3.6), sporządzony i sprawdzony zgodnie z pkt. 7 metody A.

Aparatura

Patrz pkt 4 metody A.

Procedura

5.1 Przygotowanie próbki

Ekstrakcja ppkt. 5.1-5.3 są identyczne jak w metodzie A.

Oczyszczanie na kolumnie

Dwukierunkowa chromatografia cienkowarstwowa

Nanoszenie roztworów (postępować zgodnie ze schematem na rysunku 1)

Zarysować dwie linie proste na płytce (ppkt 4.8) równolegle do dwóch sąsiednich krawędzi (odpowiednio w odległości 5 i 6 cm od każdej krawędzi), aby ograniczyć migrację czołowych części rozpuszczalnika. Pipetami kapilarnymi lub mikrostrzykawkami nanieść punktowo na płytkę następujące roztwory:

w pkt. A: 20 µl oczyszczonego ekstraktu próbki, uzyskanego w ppkt. 5.3;

w pkt. B: 20 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16);

w pkt. C: 10 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16);

w pkt. D: 20 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16);

w pkt. E: 40 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16).

Wysuszyć w łagodnym strumieniu powietrza lub gazu obojętnego (ppkt 3.11). Średnice uzyskanych plamek muszą wynosić około 5 mm.

Wywoływanie (postępować zgodnie ze schematem na rysunku 1)

Wywoływać w ciemności chromatogram w kierunku I stosując rozpuszczalnik wywołujący (ppkt 3.15.1) (1- centymetrowa warstwa w zbiorniku nasyconym), dopóki czoło rozpuszczalnika nie osiągnie linii granicznej. Wyjąć płytkę ze zbiornika i pozostawić w ciemności do wyschnięcia na 15 minut, w temperaturze otoczenia.

Następnie, wywoływać w ciemności chromatogram w kierunku II stosując rozpuszczalnik wywołujący (ppkt 3.15.2) (1- centymetrowa warstwa w zbiorniku nienasyconym), dopóki czoło rozpuszczalnika nie osiągnie linii granicznej. Wyjąć płytkę ze zbiornika i pozostawić w ciemności do wyschnięcia, w temperaturze otoczenia.

Interpretacja chromatogramu (postępować zgodnie ze schematem na rysunku 2)

Naświetlić chromatogram światłem ultrafioletowym umieszczając płytkę w odległości 10 cm od lampy (ppkt 4.9). Zlokalizować położenie niebieskich fluoryzujących plamek B, C, D i E aflatoksyny B₁ pochodzącej z roztworu standardowego. Przeprowadzić dwie wyobrażalne linie przechodzące przez powyższe punkty, pod kątami prostymi do kierunków wywoływania. Punkt przecięcia P tych linii oznacza miejsce, w którym należy się spodziewać plamki aflatoksyny B₁, pochodzącej z ekstraktu próbki naniesionego w pkt. A (rys. 1). Jednakże, rzeczywistym położeniem plamki aflatoksyny B₁ może być punkt Q, leżący na przecięciu dwóch wyobrażalnych linii prostych, tworzących między sobą kąt około 100° i przechodzących odpowiednio przez pkt. B i C. Określić ilość aflatoksyny B₁ w ekstrakcie próbki zgodnie z ppkt. 5.5.

Chromatografia uzupełniająca

Zarysować dwie linie proste na nowej płytce (ppkt 4.8) równolegle do dwóch sąsiednich krawędzi, zgodnie ze schematem na rysunku 1 i nanieść w pkt. A (patrz rysunek 1) 20 µl oczyszczonego ekstraktu próbki, uzyskanego w ppkt. 5.3 i nałożyć w to samo miejsce 20 µl roztworu wzorcowego (ppkt 3.16). Chromatogram wywołać zgodnie z ppkt. 5.4.2. Napromienić chromatogram światłem ultrafioletowym (ppkt 4.9) i sprawdzić, czy:

plamki aflatoksyny B₁ z ekstraktu i roztworu wzorcowego nakładają się;

punkt ten fluoryzuje intensywniej niż plamka aflatoksyny B₁ wywołana w punkcie Q na pierwszej płytce.

Określenia ilościowe

Określić wizualnie lub metodą fluorodensytometryczną w opisany poniżej sposób.

Pomiary wizualne przez dopasowanie

Określić ilość aflatoksyny B₁ w ekstrakcie porównując natężenie fluorescencji plamek ekstraktu z natężeniem fluorescencji plam roztworu wzorcowego w pkt. C, D i E. W razie potrzeby interpolować. Jeśli natężenie fluorescencji wywołane przez 20 µl ekstraktu jest większe niż wywołane przez 40 µl roztworu wzorcowego, należy rozcieńczyć ekstrakt 10- krotnie lub 100- krotnie chloroformem (ppkt 3.2) lub mieszaniną benzenu i acetonitrylu (ppkt 3.6) przed ponownym poddaniem go chromatografii cienkowarstwowej.

Pomiary fluorodensytometryczne

Zmierzyć natężenie fluorescencji plamek aflatoksyny B₁ fluorodensytometrem (ppkt 4.12) przy długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 443 nm. Określić ilość aflatoksyny B₁ w plamce ekstraktu porównując natężenie fluorescencji plamki ekstraktu z natężeniem fluorescencji plamek C, D i E roztworu wzorcowego.

Potwierdzenie identyczności aflatoksyny B₁

Patrz metoda A ppkt 5.6.

Obliczanie wyników

Patrz metoda A pkt 6.

Powtarzalność

Patrz metoda A pkt 8.

Odtwarzalność

Patrz „Uwagi”, część C pkt 2.