A. METODA MIKRODYFUZJI

Cel i zakres metody

Metoda ta umożliwia oznaczenie w paszach zawartości lotnych zasad azotowych wyrażonych zawartością amoniaku.

Zasada

Próbka jest ekstrahowana wodą, a roztwór jest klarowany i filtrowany. Lotne zasady azotowe są przemieszczane w drodze mikrodyfuzji przy pomocy roztworu węglanu potasowego, gromadzone w roztworze kwasu borowego i miareczkowane kwasem siarkowym.

Odczynniki

20% roztwór (procent wagowy) kwasu trójchlorooctowego,

Wskaźnik: rozpuścić 33 mg zieleni bromokrezolowej i 65 mg czerwieni metylowej w 100 ml 95%-96% etanolu (procent objętościowy).

Roztwór kwasu borowego: w 1-litrowej kolbie miarowej rozpuścić 10 g czystego kwasu borowego w 200 ml 95% - 96% etanolu (procent objętościowy) i 700 ml wody. Dodać 10 ml wskaźnika (3.2). Wymieszać i w razie potrzeby skorygować kolor roztworu do jasnoczerwonego dodając roztwór wodorotlenku sod

Nasycony roztwór węglanu potasowego: rozpuścić 100 g czystego owego. 1 ml tego roztworu wiąże maksymalnie 300 mg NH₃. węglanu potasowego w 100 ml wrzącej wody. Pozostawić do ostygnięcia i przefiltrować.

0,02-normalny kwas siarkowy.

Aparatura

Mieszarka (bębnowa): około 35 do 40 obr./min.

Szklane lub plastykowe naczynia Conway’a (patrz rysunek),

Mikrobiurety wyskalowane co 1/100 ml.

Procedura

Odważyć 10 g próbki z dokładnością do 1 mg i umieścić w 200-mililitrowej kolbie miarowej dolewając 100 ml wody. Mieszać przez 30 minut w mieszarce bębnowej. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić wodą do pełnej objętości, energicznie wstrząsnąć i przefiltrować przez filtr harmonijkowy.

Pipetą wprowadzić 1 ml roztworu kwasu borowego (3.3) do środkowej części naczynia Conway’a, a 1 ml filtratu próbki do części obwodowej naczynia. Częściowo przykryć komorę nasmarowaną pokrywą. Szybko wkroplić 1 ml nasyconego roztworu węglanu potasowego (3.4) do części obwodowej i zakryć naczynie pokrywą tak, aby było szczelne. Ostrożnie obrócić naczynie w płaszczyźnie poziomej, żeby zmieszać dwa reagenty. Pozostawić do inkubacji, przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej, albo przez 1 godzinę w temperaturze 40°C.

Mikrobiuretą (4.3) miareczkować lotne zasady w roztworze kwasu borowego 0,02-normalnym kwasem siarkowym (3.5).

Przeprowadzić ślepą próbę według tej samej procedury, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy.

Obliczanie wyników

1 ml 0,02-normalnego H₂SO₄ odpowiada 0,34 mg amoniaku. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych w tej samej próbce nie powinna przekraczać:

10% wartości względnej dla zawartości amoniaku mniejszej niż 1,0%;

0,1% wartości bezwzględnej dla zawartości amoniaku większej lub równej 1,0%.

Uwagi

Jeśli zawartość amoniaku w próbce przekracza 0,6%, należy rozcieńczyć początkowy filtrat.

NACZYNIE CONWAY’A

Skala 1:1

Widok z góry pokrywy ze szkła szlifowanego

Przekrój poprzeczny naczynia S - S1

Przekrój poprzeczny pokrywy S2 - S3 Przekrój poprzeczny pokrywy S2 - S3

Widok z góry naczynia

B. METODA DESTYLACJI

Cel i zakres metody

Metoda ta umożliwia oznaczenie zawartości lotnych zasad azotowych, wyrażonych zawartością amoniaku, w mączce rybnej praktycznie nie zawierającej mocznika. Metoda ta stosuje się tylko dla zawartości amoniaku mniejszej od 0,25%.

Zasada

Próbka jest ekstrahowana wodą, a roztwór jest klarowany i filtrowany. Lotne zasady azotowe są przemieszczane w temperaturze wrzenia przez dodanie tlenku magnezu i gromadzone w określonej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany roztworem wodorotlenku sodowego.

Odczynniki

20% roztwór (procent wagowy) kwasu trójchlorooctowego,

Czysty tlenek magnezowy,

Emulsja przeciw pieniąca (np. silikon),

0,1-normalny kwas siarkowy,

0,1-normalny roztwór wodorotlenku sodowego,

0,1% roztwór (procent wagowy) czerwieni metylowej w 95% - 96% etanolu (procent objętościowy).

Aparatura

Mieszarka (bębnowa): około 35 do 40 obr./min.

Aparatura do destylacji typu Kjeldhala.

Procedura

Odważyć 10 g próbki z dokładnością do 1 mg i umieścić w 200-mililitrowej kolbie miarowej dolewając 100 ml wody. Mieszać przez 30 minut w mieszarce bębnowej. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić wodą do pełnej objętości, energicznie wstrząsnąć i przefiltrować przez filtr harmonijkowy.

Stosownie do założonej zawartości lotnych zasad azotowych pobrać odpowiednią ilość klarownego filtratu (zwykle wystarcza 100 ml). Rozcieńczyć do 200 ml i dodać 2 g tlenku magnezu (3.2) oraz kilka kropli emulsji przeciw pieniącej (3.3). Roztwór powinien być alkaliczny przy sprawdzaniu papierkiem lakmusowym; w przeciwnym razie dodać niewielką ilość tlenku magnezu (3.2). Poddać destylacji około 150 ml roztworu w aparaturze Kjeldhala i zebrać destylat w kolbie Erlenmeyera zawierającej dokładnie odmierzoną objętość (25 ml do 50 ml) 0,1-normalnego kwasu siarkowego (3.4). Podczas destylacji unikać przegrzewania boków. Gotować przez 2 minuty roztwór kwasu siarkowego, ostudzić go, a nadmiar odmiareczkować kwasem siarkowym z 0,1-normalnym roztworem wodorotlenku sodowego (3.5) w obecności wskaźnika z czerwieni metylowej (3.6).

Przeprowadzić ślepą próbę według tej samej procedury, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy.

Obliczanie wyników

1 ml 0,1-normalnego H₂SO₄ odpowiada 1,7 mg amoniaku. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych w tej samej próbce nie powinna przekraczać 10% zawartości względnej amoniaku.

3. OZNACZANIE CAŁKOWITEJ ZAWARTOŚCI FOSFORU

Metoda fotometryczna

Cel i zakres metody

Metoda ta umożliwia oznaczenie całkowitej zawartości fosforu w paszach. Nadaje się ona szczególnie do analizy produktów o małej zawartości fosforu. W pewnych przypadkach (produkty bogate w fosfor), można stosować metodę grawimetryczną.

Zasada

Próbka jest mineralizowana albo przez suche spalanie (w przypadku pasz organicznych), albo poprzez trawienie kwasem (w przypadku związków mineralnych i pasz ciekłych) i umieszczana w roztworze kwasu. Roztwór jest traktowany odczynnikiem molibdenowo - wanadanowym. Gęstość optyczną powstałego w ten sposób żółtego roztworu mierzy się spektrofotometrem przy długości fali 430 nm.

Odczynniki

Czysty węglan wapnia,

Czysty kwas chlorowodorowy o gęstości 1,1 (w przybliżeniu 6-normalny),

Czysty kwas azotowy o gęstości 1,045,

Czysty kwas azotowy o gęstości 1,38-1,42,

Czysty kwas siarkowy o gęstości 1,84

Odczynnik molibdenowo - wanadanowy: w 1-litrowej kolbie miarowej wymieszać 200 ml roztworu heptamolibdenianu amonowego (3.6.1), 200 ml roztworu monowanadanu amonowego (3.6.2) i 134 ml kwasu azotowego (3.4). Uzupełnić do pełnej objętości wodą.

3.6.1. Roztwór heptamolibdenianu amonowego: rozpuścić w gorącej wodzie 100 g czystego heptamolibdenianu amonowego (NH₄) 6Mo₇ O₂₄×4 H₂O. Dodać 10 ml amoniaku (o gęstości 0,91) i uzupełnić wodą do 1 litra.

3.6.2. Roztwór monowanadanu amonowego: 2,35 g czystego monowanadanu amonowego NH₄VO₂ rozpuścić w 400 ml gorącej wody. Ciągle mieszając powoli dodawać 20 ml rozcieńczonego kwasu azotowego (7 ml HNO₃ (3.4) + 13 ml H₂O) i uzupełnić wodą do 1 litra.

3.7 Wzorcowy roztwór 1 mg fosforu na ml: rozpuścić w wodzie 4,387 g czystego dwuwodorofosforanu potasowego KH₂PO₄. Uzupełnić wodą do 1 litra.

Aparatura

Kwarcowe lub porcelanowe tygle do spopielania,

Elektryczny piec muflowy z termostatem nastawionym na 550°C,

Kolba Kjeldahla o pojemności 250 ml,

Kolby miarowe i dokładne pipety,

Spektrofotometr

Probówki o średnicy około 16 mm i pojemności 25 ml-30 ml z korkami stopniowanymi do średnicy 14,5 mm.

Procedura

5.1 Przygotowanie roztworu

W zależności od rodzaju próbki przygotować roztwór według ppkt. 5.1.1 lub 5.1.2.

5.1.1 Typowa procedura

Odważyć co najmniej 1 g próbki z dokładnością do 1 mg. Umieścić próbkę w kolbie Kjeldahla, dodać 20 ml kwasu siarkowego (3.5), wstrząsnąć, żeby nasycić substancję całkowicie kwasem i zapobiec jej przyklejaniu się do ścianek kolby, podgrzać i utrzymywać w stanie wrzenia przez 10 minut. Nieznacznie ostudzić, dodać 2 ml kwasu azotowego (3.4), lekko podgrzać, nieznacznie ostudzić, dodać trochę więcej kwasu azotowego (3.4) i doprowadzić ponownie do wrzenia. Powtarzać procedurę do momentu uzyskania bezbarwnego roztworu. Ostudzić roztwór, dolać trochę wody, przelać ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml płucząc kolbę Kjeldahla gorącą wodą. Pozostawić do ostygnięcia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, poddać homogenizacji i przefiltrować.

5.1.2 Próbki zawierające substancje organiczne i wolne od dwuwodorofosforanów wapnia i magnezu

W tyglu do spopielania odważyć 2,5 g próbki z dokładnością do 1 mg. Próbkę mieszać aż do całkowitego połączenia się z 1 g węglanu wapniowego (3.1). Spopielać w piecu w temperaturze 550°C ± 5°C aż do uzyskania białego lub szarego popiołu (niewielka ilość węgla drzewnego nie ma znaczenia).

Przesypać popiół do 250-mililitrowej zlewki. Dodać 20 ml wody oraz kwasu chlorowodorowego (3.2) aż do ustania pienienia. Dodać kolejne 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.2). Postawić zlewkę na łaźni piaskowej i odparować całkowicie wodę, aby uczynić krzemionkę nierozpuszczalną. Ponownie rozpuścić pozostałość w 10 ml kwasu azotowego (3.3) i gotować na łaźni piaskowej przez 5 minut do całkowitego wysuszenia bez odparowywania wody. Przelać ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml przepłukując zlewkę kilka razy gorącą wodą. Pozostawić do ostygnięcia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, poddać homogenizacji i przefiltrować.

Wywołanie zabarwienia i pomiar gęstości optycznej

Rozcieńczyć podwielokrotność filtratu uzyskanego w ppkt. 5.1.1 lub 5.1.2 w celu uzyskania stężenia fosforu nie większego niż 40 mg na ml. Wlać 10 ml tego roztworu do probówki (4.6) i dodać 10 ml odczynnika molibdenowo-wanadanowego (3.6). Poddać homogenizacji i pozostawić do odstania, na co najmniej 10 minut w temperaturze 20°C. Spektrofotometrem, przy długości fali 430 nm, zmierzyć gęstość optyczną roztworu uzyskanego przez dodanie 10 ml odczynnika molibdenowo-wanadanowego (3.6) do 10 ml wody.

Krzywa wzorcowania

Na bazie roztworu wzorcowego (3.7) sporządzić roztwory zawierające odpowiednio 5, 10, 20, 30 i 40 mg fosforu na ml. Pobrać po 10 ml każdego z tych roztworów i do każdej porcji dodać 10 ml odczynnika molibdenowo-wanadanowego (3.6). Poddać homogenizacji i pozostawić do odstania na co najmniej 10 minut w temperaturze 20°C. Zmierzyć gęstość optyczną zgodnie z ppkt. 5.2.

Sporządzić krzywą wzorcowania wykreślając gęstości optyczne w funkcji odpowiadających im stężeń fosforu. Dla stężeń w przedziale od 0 do 40 mg/ml krzywa będzie liniowa.

Obliczanie wyników

Oznaczyć ilość fosforu w próbce korzystając z krzywej wzorcowania.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie powinna przekraczać:

3% wartości względnej dla zawartości fosforu mniejszej niż 5%;

0,15% wartości bezwzględnej dla zawartości fosforu większej lub równej 5%.

4. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI SUROWYCH OLEJÓW I TŁUSZCZÓW

Cel i zakres metody

Metoda ta umożliwia oznaczenie zawartości surowych olejów i tłuszczów w paszach. Nie obejmuje ona analizy nasion i owoców oleistych zdefiniowanych w rozporządzeniu Rady 136/66/EWG z dnia 22 września 1966 r. Oznaczenie zawartości oleju w tych produktach opisane jest w załączniku V do rozporządzenia Komisji (EWG) nr 1470/68 z dnia 23 września 1968 r.

W zależności od rodzaju paszy można stosować jedną z dwóch metod.

Metoda A (ekstrakcja eterem): stosowana do wszystkich pasz oprócz wymienionych w ppkt. 1.2.

Metoda B: stosowana do pasz, z których olejów lub tłuszczy nie można całkowicie wyekstrahować eterem etylowym bez uprzedniej hydrolizy, do pasz pochodzenia zwierzęcego, glutenów, suszonych papek ziemniaczanych, suszonych osadów i odpadków browarnianych i destylacyjnych, suszonych drożdży, odpadków z sucharów, chleba i potraw gotowanych, produktów mlecznych i pasz o dużej ich zawartości, (co najmniej 40%) i do pasz złożonych, wzbogacanych tłuszczami.

Zasada

2.1 Metoda A: Oleje i tłuszcze są ekstrahowane eterem etylowym. Rozpuszczalnik jest eliminowany, a pozostałość suszona i ważona.

2.2 Metoda B: Próbka jest hydrolizowana na ciepło kwasem chlorowodorowym. Roztwór jest chłodzony i filtrowany. Pozostałość jest wymywana, suszona i ekstrahowana eterem etylowym zgodnie z metodą A.

Odczynniki

Bezwodny eter etylowy o gęstości 0,720, temperatura wrzenia 34,5°C, rzeczywiście pozbawiony nadtlenków,

Czysty, bezwodny siarczan sodowy,

3-normalny kwas chlorowodorowy,

Pomocniczy materiał filtracyjny, np. Kieselgur, Hyflo-supercel,

Czysty czterochlorek węgla.

Aparatura

Ekstraktor typu Soxhlet lub równoważny,

Aparatura przeciwwybuchowa z regulacją temperatury,

Piec próżniowy do suszenia (poniżej 100 torów).

Procedura

5.1 Metoda A: (patrz 7.1)

Odważyć 5 g próbki z dokładnością do 1 mg i wymieszać 2 g-3 g (lub w razie potrzeby z większą ilością) siarczanu sodowego (3.2). Mieszaninę umieścić w gilzie do ekstrakcji wolnej od olejów i tłuszczów i przykryć odtłuszczonym zwitkiem waty. (Mieszanie można przeprowadzić w gilzie do ekstrakcji).

Umieścić gilzę w ekstraktorze (4.1) i ekstrahować przez 6 godzin eterem etylowym (3.1). W razie użycia ekstraktora typu Soxhlet, wyregulować ogrzewanie, aby uzyskać co najmniej 15 syfonowań na godzinę. Zebrać ekstrakt eteru w suchej, zważonej kolbie, zawierającej kawałki pumeksu(⁴).

Oddestylować eter i wysuszyć pozostałość po odparowaniu przez półtorej godziny w próżniowym piecu do suszenia (4.3) w temperaturze 75°C. Ostudzić w suszarce i zważyć. Suszyć ponownie przez 30 minut, aby sprawdzić, czy masa olejów i tłuszczy pozostaje stała (ubytek masy musi być mniejszy niż 1 mg).

5.2 Metoda B

Odważyć 2,5 g próbki z dokładnością do 1 mg (patrz 7.2) i umieścić w 400-mililitrowej zlewce lub 300-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Dodać 100 ml 3-normalnego kwasu chlorowodorowego (3.3) i kawałki pumeksu. Przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym lub wyposażyć kolbę Erlenmeyera w chłodnicę zwrotną. Doprowadzić mieszaninę do słabego wrzenia nad wolnym ogniem lub płytą grzejną i utrzymywać w tym stanie przez jedną godzinę. Nie dopuścić do przyklejania się produktu do ścianek pojemnika.

Ostudzić i dodać pewną ilość pomocniczego materiału filtracyjnego (3.4), wystarczającą, aby zapobiec ubytkowi oleju i tłuszczu podczas filtracji. Filtrować przez zwilżoną, odtłuszczoną, podwójną bibułę filtracyjną. Pozostałość wymywać zimną wodą, dopóki nie ustanie reakcja z kwasem. Sprawdzić, czy filtrat nie zawiera olejów lub tłuszczów. Ich obecność w filtracie wskazuje na konieczność ekstrakcji próbki, przed hydrolizą, eterem etylowym metodą podaną w ppkt. 5.1.

Położyć podwójną bibułę filtracyjną z pozostałością pofiltracyjną na szkiełku zegarkowym i suszyć przez półtorej godziny w piecu w temperaturze 95°C-98°C.

Umieścić podwójną bibułę filtracyjną z pozostałością pofiltracyjną w gilzie ekstrakcyjnej, ekstrahować eterem etylowym i postępować zgodnie z ppkt. 5.1 akapit drugi.

Obliczanie wyników

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych w tej samej próbce nie powinna przekraczać 0,3% oleju lub tłuszczu.

Uwagi

W przypadku produktów o dużej zawartości olejów i tłuszczów oraz trudnych do rozdrobnienia lub pobrania jednorodnej, zmniejszonej próbki, należy postępować w następujący sposób. Odważyć 20 g próbki z dokładnością do 1 mg i wymieszać z 10 g lub większą ilością bezwodnego siarczanu sodowego (3.2). Ekstrahować eterem etylowym (3.1) zgodnie z ppkt. 5.1. Uzyskany ekstrakt uzupełnić do 500 ml czterochlorkiem węgla (3.5) i poddać homogenizacji. Pobrać 50 ml roztworu i nalać do małej, suchej, zważonej kolby zawierającej kawałki pumeksu(⁵). Oddestylować rozpuszczalnik, wysuszyć i postępować według ppkt. 5.1 akapit ostatni. Usunąć rozpuszczalnik z pozostałości ekstrakcji w gilzie ekstrakcyjnej i rozdrobnić pozostałość tak, aby uzyskać stopień rozdrobnienia 1 mm. Ponownie wrzucić produkt do gilzy ekstrakcyjnej (nie dodawać siarczanu sodowego), ekstrahować eterem etylowym i postępować według ppkt. 5.1 akapit drugi i trzeci.

Wynik obliczyć jako udział procentowy w próbce, uwzględniając podwielokrotność użytą do pierwszej ekstrakcji, według następującego wzoru:

(10 a + b) x 5

gdzie:

a = masa ekstraktu eteru podwielokrotności próbki po pierwszej ekstrakcji, w gramach

b = masa ekstraktu eteru po drugiej ekstrakcji, w gramach

W przypadku produktów o małej zawartości olejów i tłuszczów masę próbki można zwiększyć do 5 g.